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Advances in Fragment-Based Drug Discovery : studies of cAMP-dependent protein-kinase A using X-ray-crystallography, surface-plasmon-resonance and high compound concentration assays

Hillertz, Per

German Title: Fortschritte in Fragment-basierte Medikamententwicklung

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Abstract

Development of a new, or candidate, therapeutic drug is a challenging process that must ensure that favorable target selectivity, potency, pharmacokinetics, and pharmacodynamics, as well as lack of toxicity, all fall within the therapeutic window. During the hit-optimiza­tion stage, the focus shifts toward optimizing potency and target selectivity. Fragment-based methods have recently been developed to the point where they represent a promising strategy in drug discov­ery, where a variety of biophysical techniques may be employed for fragment library screen­ing and characterizing hit-fragments. Hit-fragments deduced from fragment-based screenings typically have ligand efficiencies (LE) exceeding those of average HTS‑hits. Structure data on the complexes formed by fragment-target-protein structures yield a much-better starting point for hit optimization and lead discovery. This dissertation presents two fragment-screening studies. Under the first, surface-plasmon-resonance (SPR) analyses and biochemical assays at high compound concentrations (HCA) were employed in primary screenings of protein-kinase A (PKA) that were followed by X-ray crystallographic determinations of the structures of the PKA‑frag­ments involved. The aim of that study was testing the characteristics, outcomes, and limits of both SPR and HCA as fragment-screening methods, as well as estimating hit rates that could be confirmed by X‑ray crystallographic analyses. Under the second, in-house, biochemi­cal-assay data were used for selecting the fragment-like inhibitors of PKA to be subjected to X‑ray crystallo­graphic structure determina­tions. The biochemical-assay data involved were taken from screening cam­paigns, such as high-through­put screenings (HTS), or other, available, in-house, biochemi­cal-assay runs. The goal there was estimating the extent to which existing HTS‑data might be util­ized for obtaining three-dimensional, fragment-target, protein structure data, without need for conducting any additional fragment-screening runs. Following screening a library of 257 fragment-like compounds using SPR and HCA, a total of 26 hit-fragments were chosen for X-ray structure determinations, which yielded the structures of nine frag­ment-PKA-struc­tures. Under the second approach, 67 fragments exhibiting > 50 % inhibi­tions taken from the avail­able, in-house, biochemical-assay data were selected for structure deter­min­a­tions, which yielded the structures of 21 fragment-PKA-complexes. Both approaches yielded respectable hit rates and descriptions of the characteristics of numerous fragment-pro­tein interactions. The structural information and data on fragment-target-protein complexes gained from those two setups might well accelerate the drug-discovery process throughout the pharmaceutical industry.

Translation of abstract (German)

Die Entwicklung eines neuen therapeutischen Arzneimittels ist ein umfassender Prozess. Sie schließt umfangreiche Studien von Wirksamkeit, Selektivität, Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und Toxizitätsbestimmungen ein. Während der Hit-Optimierungsstufe liegt der Fokus auf der Optimierung von Bindungsaffinität und Selektivität. Als vielversprechende Strategie werden seit kurzem Fragment-basierte Studien als neue Methode im Bereich der Wirkstoffidentifizierung angewendet (Fragment Based Drug Discovery - FBDD). Dabei kommen eine Vielzahl biophysikalischer Technologien für das sogenannte Fragment-Screening und die Charakterisierung von Hit-Fragmenten zum Einsatz. Die im Fragment-Screening gefundenen Hit-Moleküle haben in der Regel eine höhere Ligand-Effizienz (LE) als HTS-hits. Die nachfolgende Aufklärung des Bindungsmodus der Fragment-Hits im Proteintarget durch Röntgenstrukturanalyse ist essentieller Bestandteil des Fragment-Screenings. Die Strukturdaten dieser Fragment-Target-Proteinstrukturen gebildet geben einen viel besseren Ausgangspunkt für die folgende Hit-Optimierung durch rationales Design. Die vorliegende Dissertation präsentiert zwei Fragment-basierte Studien zum Screening von Protein-Kinase A (PKA) Inhibitoren. Zuerst wurden Oberflächen-Plasmon-Resonanz (Surface Plasmon Resonance - SPR) Analysen und biochemische Inhibitionsmessungen bei hohen Fragment Konzentrationen (High Concentration Assay - HCA) durchgeführt. Danach erfolgte die Strukturbestimmung der PKA-Fragment Komplexe mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse. Das Ziel dieser Studie war die Prüfung der Kenndaten, Ergebnisse und Grenzen von SPR und HCA als Fragment-Screening-Methoden, sowie die Bestätigung der Fragment-hits durch Röntgenstrukturanalyse. In der zweiten Studie wurden Daten eines bei Merck etablierten biochemischen Assays für die Fragmentwahl herangezogen und ebenfalls die Struktur dieser Fragment-PKA Komplexe kristallographisch bestimmt. Die biochemischen Inhibitionsdaten werden parallel zu den Screening-Kampagnen, wie z. B. High-Throughput-Screening (HTS) und anderen Merck internen Tests erfasst. Ziel war es, zu klären, in welchem Umfang bestehende HTS-Daten ohne zusätzliches Fragment Screening für den Erhalt von drei-dimensionalen Fragment-Target-Protein-Struktur-Daten genutzt werden können. Es wurde eine Bibliothek von 257 Fragment Molekülen mittels SPR und HCA gescreent. Aus den Ergebnissen wurden insgesamt 26 Hit-Fragmente für X-ray Bestimmungen gewählt, woraus neun Fragment-PKA-Strukturen gelöst werden konnten. Im zweiten Ansatz wurden 67 Fragmente für die Röntgenstrukturanalyse ausgewählt, die in den biochemischen Inhibitionsmessungen eine mehr als 50%ige Hemmungen der PKA Substrat-Phosphorylierung zeigten. Aus diesem Ansatz ergaben sich 21 Fragment-PKA-Komplex Strukturen. Beide Ansätze ergaben beachtliche Trefferquoten und interessante Bindungsmodi der Fragment-Protein-Interaktionen. Die in dieser Arbeit identifizierten Fragmente und Proteinstukturen zeigen den Erfolg Fragment-basierter Methoden in der Wirkstoffforschung.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Sinning, Prof. Dr. Irmgard
Date of thesis defense: 19 May 2010
Date Deposited: 20 May 2010 14:29
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Fragment Based Drug Discovery , Surface plasmon resonance , Protein crystallography , Pre-clinical drug discovery
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