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Biochemical Characterization of the Drosophila Polycomb protein dSfmbt

Vidal Matos, Raquel

German Title: Biochemische Charakterisierung des Drosophila Polycomb protein dSfmbt

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Abstract

Polycomb group (PcG) proteins are transcriptional regulators that maintain the repression of a large set of developmental control genes. PcG proteins form distinct multiprotein complexes: PhoRC (Pho Repressive Complex), PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1), PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) and its variant Pcl-PRC2. These complexes repress target genes by modifying their chromatin. PcG chromatin modifications are thought to provide a memory that permits the transcriptional OFF state to be maintained in a heritable manner. PcG protein complexes assemble at specific cis-regulatory sequences called Polycomb Response Elements (PREs). Although all PcG complexes are targeted to PREs, only the PhoRC subunit Pho has sequencespecific DNA binding activity. The mechanism by which PRC1 or PRC2 are targeted and tethered at PREs is only poorly understood. During my Ph. D. studies, I performed a biochemical characterization of dSfmbt, the protein that together with Pho forms PhoRC. Using a Tandem Affinity Purification strategy, I purified proteins associated with dSfmbt. These purified complexes contained not only dSfmbt and Pho but also the histone deacetylase Rpd3, the histone chaperone NAP1, the chromatin binding protein HP1b, and an uncharacterized protein, CG3363. This is further supported by the observation that in addition to the Pho and dSfmbt also Rpd3 is bound to PREs of PcG target genes. dSfmbt forms a stable complex with the PRC1 subunit Scm in vitro and these two proteins are bound at PREs of PcG target genes. Using genetic interaction assays, I found that Scm and dSfmbt act in a highly synergistic manner to repress PcG target genes in vivo during Drosophila development. Taken together, these studies thus suggest that the PhoRC complex comprises not only Pho and dSfmbt but also additional chromatinmodifying and chromatin-binding subunits. The molecular and functional interactions between dSfmbt and Scm underscore the central role of dSfmbt as a molecular adaptor between the DNA-binding Pho subunit and PRC1.

Translation of abstract (German)

Die Proteine der Polycomb-Gruppe (Polycomb group, PcG) sind Transkriptionsregulatoren, die die Repression einer Vielzahl von Zielgenen aufrecht erhalten. Sie bilden separate Multiproteinkomplexe: PhoRC (Pho Repressive Complex), PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1), PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) und dessen Variante Pcl-PRC2. Diese Komplexe reprimieren ihre Zielgene, indem sie deren Chromatin modifizieren. Von solchen PcG-Modifikationen wird angenommen, dass sie ein “Gedächtnis” für den inaktiven Transkriptionsstatus (OFF state) erbringen, der so auf vererbbare Weise aufrechterhalten wird. Die PcG-Komplexe assemblieren auf spezifischen cis-regulatorischen Sequenzen, den sogenannten PREs (Polycomb Response Elements). Obwohl alle PcG-Komplexe auf den PREs vorhanden sind, bindet nur die Pho- Untereinheit des PhoRC sequenz-spezifisch an DNA. Es ist bisher nicht ausreichend verstanden, durch welchen Mechanismus PRC1 und PRC2 die PREs erkennen und binden. Im Rahmen meiner Doktorarbeit habe ich das PcG-Protein dSfmbt, das zusammen mit der Pho-Untereinheit den PhoRC bildet, biochemisch charakterisiert. Mit Hilfe der Tandem-Affinitätsreinigungstechnik (Tandem Affinity Purification) habe ich Proteine identifiziert, die mit dSfmbt assoziieren. Die gereinigten Komplexe enthielten nicht nur dSfmbt und Pho, sondern auch die Histon-Deacetylase Rpd3, das Histon-Chaperon NAP1, das Chromatin-bindende Protein HP1b und ein uncharakterisiertes Protein, CG3363. Dieses Ergebnis wird weiter dadurch unterstützt, dass zusätzlich zu Pho und dSfmbt auch Rpd3 auf den PREs von PcG-Zielgenen gebunden ist. dSfmbt bildet in vitro einen stabilen Komplex mit der PRC1-Komponente Scm und diese beiden Proteine sind ebenfalls auf den PREs von PcG-Zielgenen gebunden. Ich habe mit Hilfe von genetischen Interaktionsexperimenten festgestellt, dass Scm und dSfmbt in vivo im Rahmen der Drosophila-Entwicklung ihre Zielgene mit stark ausgeprägter Synergie reprimieren. Zusammenfassend legen diese Untersuchungen also nahe, dass PhoRC nicht nur die Untereinheiten Pho und dSfmbt besitzt, sondern zusätzliche chromatin-bindende und – modifizierende Komponenten umfasst. Die molekularen und funktionellen Interaktionen zwischen dSfmbt und Scm unterstreichen die zentrale Rolle von dSfmbt als molekularem Adapter zwischen der DNA-bindenden Pho-Untereinheit und PRC1.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Sinning, Prof. Dr. Irmgard
Date of thesis defense: 9. October 2009
Date Deposited: 02. Jun 2010 11:29
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: dSfmbt , Polycomb
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