English Title: Second Harmonic Generation Microscopy in Biomedical Applications

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Abstract

Frequenzverdopplung (SHG) von Licht kann durch verschiedene wichtige Proteinstrukturen in biologischen Proben selbst hervorgerufen werden. Zu diesen zählen vor allem das extrazelluläre Matrixprotein Collagen und das Motorprotein Myosin in der quergestreiften Muskulatur. Mit Hilfe von Kurzpulslasern und Laser-Scanning Mikroskopie können die SHG Signale dazu genutzt werden, um diese Proteinstrukturen ohne den Zusatz externer Marker hochauflösend darzustellen. Das Hauptziel dieser Arbeit ist eine biomolekulare und physikalische Charakterisierung des SHG Signals von Muskelpräparaten und eine Diskussion von Anwendungsmöglichkeiten an der Haut im Kontext von Hautkrebs und Sklerodermie. Am Muskel wurde speziell die Orientierungsabhängigkeit des SHG Signals von der Polarisation des Lasers untersucht. Komplementär dazu wurden theoretische Modelle zur quantitativen Beschreibung und zum Verständnis der beobachteten Effekte entwickelt. Erstmals wurde hier auch ein Modell der Verteilung des elektrischen Feldes im Objektivfokus in die Berechnungen mit einbezogen. Das zentrale Ergebnis dieser Experimente ist, dass die SHG Polarisationsabhängigkeit im Muskel in den physiologischen Zuständen Relaxed und Rigor unterschiedlich ist. Auf diese Weise lässt sich also der funktionale molekulare Zustand der Myosinmoleküle aus der SHG Signalcharakteristik ablesen. An der Haut konnte durch SHG und Autofluoreszenz Signale die Struktur der obersten Hautschichten in vivo mit hoher Auflösung dreidimensional abgebildet werden. Die SHG Mikroskopie verspricht eine besondere Eignung als nicht-invasives Werkzeug zum Studium von Hauterkrankungen.

Translation of abstract (English)

Several biologically relevant protein structures are known as sources for second harmonic generation (SHG) signals. Among these are collagen, an extracellular matrix protein, and the motor protein myosin in striated muscle. In combination with short-pulse lasers and laser-scanning microscopy, SHG signals can provide high-resolution imaging of these structures without the need for extrinsic labels. The main objective of this study is to characterize the physical and biomolecular properties of SHG from mammalian skeletal muscle and further to discuss applications of SHG microscopy to the skin in the context of skin cancer and scleroderma. In muscle, a special focus lay on the SHG orientation dependency on the axis of laser polarization. Complementary to the experimental work, several theoretical models were developed for a precise quantitative description and a deeper understanding of the observed effects. For the first time, the entire electric field distribution in the focus of the objective was considered here for the modeling of the polarization dependency. The central result of the conducted experiments is that the SHG polarization dependency is different for the two physiological states relaxed and rigor in muscle, which means that the functional molecular state of the myosin molecules is expressed in the SHG signal characteristics. In murine skin, SHG and autofluorescence signals showed the three-dimensional structure of the upper skin layers in vivo with high resolution. SHG microscopy proposes excellent suitability as a non-invasive tool for studying cutaneaous conditions.