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Analysis of coding microsatellite mutations in MSI colorectal carcinomas and characterization of their effects on the cellular glycosylation machinery

Röckel, Nina

German Title: Analyse kodierender Mikrosatelliten-Mutationen in MSI kolorektalen Karzinomen und Charakterisierung ihrer Effekte auf die Glykosylierungs-Maschinerie

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Abstract

Microsatellite instability (MSI), i.e. length variations of repetitive DNA sequences (microsatellites) occurs in colorectal cancer (CRC) due to defects in the DNA mismatch repair (MMR) system and is a hallmark of tumors associated with hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC, 1 – 5% of total CRC) as well as sporadic CRC (15% of total CRC). Instability in coding region microsatellites (cMNR) of expressed genes lead to frameshift mutations and a subsequent loss of protein function or the translation of a truncated protein. Despite the obvious significance of altered glycoprotein synthesis, transport and glycosylation patterns in colorectal cancer, aberrant glycosylation and glycosylation pathways have not been investigated in MSI colorectal tumors. Using a bioinformatics-based approach 28 cMNR harboring candidate genes were identified that encode proteins of the cellular glycosylation machinery. Coding MNR mutation analysis in MSI CRC cell lines revealed a high mutation frequency in two genes: the glycoprotein transporter gene LMAN1/ERGIC53 (52%; 12/23) and the xylosyltransferase gene XYLT2 (35%; 8/23) that catalyzes the first step in proteoglycan synthesis. Apart from their occurrence in cultured cell lines these genetic alterations were also found at similar frequency in MSI colorectal adenomas (LMAN1: 40%, 8/20; XYLT2: 21%, 4/19) as well as carcinomas (LMAN1: 46%, 78/170; XYLT2: 26%, 27/105). Biallelic mutations, abrogating normal protein function, were detected in MSI CRC cell lines (LMAN1, XYLT2) and in primary colorectal tumors (LMAN1). Biallelic mutant LMAN1 was transcribed but not translated into a stable protein in MSI CRC cell lines or LMAN1-mutated areas in tumors. MSI CRC cell lines with biallelic LMAN1 mutations behaved different to LMAN1-proficient CRC cell lines. LMAN1-deficient cell lines exhibited severely reduced transport and secretion of the LMAN1 cargo protein alpha-1-antitrypsin (A1AT), an inhibitor of angiogenesis and tumor growth but impaired secretion could be restored upon LMAN1 re-expression. A strong correlation between lower local levels of A1AT and enhanced tumor growth has been described. Furthermore, re-expression of LMAN1 in LMAN1-deficient LoVo cells led to a cell surface glycoprotein pattern different from the pattern observed on LoVo cells lacking LMAN1. Increased binding of PHA-L lectins to the cell surface suggested a glycosylation pattern known to be involved in the progression of cancer from a tumorigenic to a metastatic phenotype. A radioactive incorporation assay with 3H-xylose also revealed changes in proteoglycan synthesis of a XYLT2-deficient MSI CRC cell line transiently transfected with a XYLT2-construct. Overall, two members of the cellular glycosylation machinery, a glycoprotein transporter and a glycosyltransferase, appear to be involved in MSI tumorigenesis. Genetic alterations in LMAN1 and XYLT2 mark early events already detectable in preneoplastic lesions. Furthermore, loss of LMAN1 and XYLT2 protein function changed the secretion of proteins and the cell surface glycosylation pattern. Both genes might influence MSI tumor progression by changing cell-cell communication and interactions.

Translation of abstract (German)

Mikrosatelliten-Instabilität (MSI), d.h. Längenvariationen in repetitiven DNA-Sequenzen (Mikrosatelliten), wird in kolorektalen Karzinomen (CRC) durch die funktionelle Inaktivierung eines zellulären DNA-Reparatursystems verursacht, dem sogenannten Mismatch-Reparatur (MMR) System. MSI ist ein Kennzeichen von MSI-Darmtumoren, die entweder sporadisch (15% aller Kolonkarzinome) oder im Rahmen des hereditären nicht-polypösen Kolonkarzinoms (hereditary non-polyposis colorectal cancer HNPCC; 15% aller Kolonkarzinome) entstehen. Instabilität in Mikrosatelliten eines kodierenden Genabschnitts (cMNR) exprimierter Gene, führen zu Basenfehlpaarungen, die anschließend einen Verlust der Proteinfunktion oder die Entstehung verkürzter Proteine (Neopeptide) zur Folge haben. Eine veränderte Glykoprotein-Synthese, veränderter Transport und ein verändertes Glykolisierungsmuster haben eine offensichtliche Bedeutung in kolorektalen Karzinomen, allerdings wurden abnormale Glykosylierung und Glykosylierungswege bisher nicht in MSI kolorektalen Tumoren untersucht. Unter Verwendung von Datenbank-Analysen wurden 28 Kandidatengene mit einem cMNR identifiziert. cMNR-Leserastermutations-Analysen bei einer Auswahl von MSI CRC Zellinien zeigten bei zwei Genen eine hohe Mutationsfrequenz: bei dem Glykoprotein-Transporter Gen LMAN1/ERGIC53 (52%; 12/23) und dem Xylosyltransferase Gen XYLT2 (35%; 8/23), das den ersten Schritt der Proteoglykan-Synthese katalysiert. Neben genetischen Veränderungen in MSI CRC Zellinien wurden ähnlich hohe Mutationsfrequenzen in MSI kolorektalen Adenomen (LMAN1: 40%, 8/20; XYLT2: 21%, 4/19) und in MSI kolorektalen Karzinomen (LMAN1: 46%, 78/170; XYLT2: 26%, 27/105) beobachtet. Biallelische Mutationen, die eine veränderte Proteinfunktion zur Folge haben, wurden in MSI CRC Zellinien (LMAN1, XYLT2) und in primären kolorektalen Tumoren (LMAN1) gefunden. Das biallelisch mutierte LMAN1-Gen wurde in MSI Darmkrebs-Zellinien transkribiert, jedoch nicht in ein stabiles Protein translatiert. Auch im Gewebe konnte eine biallelische LMAN1-Mutation mit einem Proteinverlust assoziiert werden. MSI Darmzellinien mit biallelischen LMAN1-Mutationen zeigten ein verändertes Verhalten im Vergleich zu LMAN1-exprimierenden MSI Darmzellinien. LMAN1-defiziente Zellinien wiesen einen reduzierten Transport und eine reduzierte Sekretion von einem LMAN1-Transportprotein Alpha-1-Antitrypsin (A1AT) auf. A1AT ist ein Inhibitor der Angiogenese und des Tumorwachstums. Die eingeschränkte A1AT-Sekretion konnte durch Re-Expression von LMAN1 in LMAN1-defizienten Zellinien wieder hergestellt werden. Es wurde gezeigt, dass ein Verlust der A1AT-Sekretion einen Wachstumsvorteil für den Tumor darstellt. Außerdem führte ein LMAN1-Verlust zu einem veränderten Glykosylierungsmuster an der Zelloberfläche von LMAN1-defizienten LoVo Zellen im Vergleich zu LoVo Zellen, die LMAN1 stabil exprimierten. Die vermehrte Bindung von PHA-L Lektinen an die Zelloberfläche war verbunden mit mehr β1-6 Verzweigungen in LMAN1-defizienten LoVo Zellen. β1-6 Verzweigungen sind Glykosylierungsmuster, die mit der Tumorprogression und der Metastasen-Entstehung in Verbindung gebracht werden. Der radioaktive Einbau von 3H-Xylose zeigte Veränderungen in der Proteoglykan-synthese XYLT2-defizienter MSI-Darmzellinien, die mit einem XYLT2-Konstrukt transient transfiziert wurden. Es wurden insgesamt zwei Mitglieder der zellulären Glykosylierungsmaschinerie, ein Glykoproteintransporter und eine Glykosyltransferase, identifiziert, die einen Einfluss auf die MSI Tumorgenese haben könnten. Genetische Veränderungen in LMAN1 und XYLT2 sind früh auftretende Ereignisse, die bereits in prä-neoplastischen Läsionen nachweisbar waren. Zudem änderte der Verlust von LMAN1 und XYLT2 die Sekretion von Proteinen und das Glykosylierungsmuster an der Zelloberfläche. Beide Gene könnten die MSI Tumorprogression durch eine veränderte Zell-Zell Kommunikation oder Interaktion beeinflussen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dobberstein, Dr. rer. n Bernhard
Date of thesis defense: 22 September 2010
Date Deposited: 11 Oct 2010 14:50
Date: 2010
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Pathologisches Institut
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Microsatellite Instability , Colorectal Cancer , Glycosylation , LMAN1
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