German Title: STED-Mikroskopie mit Lichtquellen basierend auf stimulierter Raman-Streuung

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Abstract

Light sources offering a spectrally flexible output in the yellow-orange region of the visible spectrum are of great interest for stimulated emission depletion (STED) microscopy because they enable super-resolution imaging of the fluorescent proteins which emit in this range, in particular the green and yellow fluorescent proteins (GFP and YFP) and their variants. Lasers exist which produce yellow-orange light, but each has distinct disadvantages for use in a STED microscope. Titanium:sapphire lasers pumping optical parametric oscillators are used, but are technically complex and often require careful adjustment. Single-color fiber lasers are an option but do not offer valuable spectral tunability. Supercontinuum fiber lasers, due to the fact that they generate broad continua, have low pump conversion efficiencies to narrow wavelength ranges within their output spectrum, ultimately limiting the repetition rate and output power in a narrow spectral range. This thesis presents a novel light source for STED microscopy based on stimulated Raman scattering (SRS) in standard optical fiber. The source produces pulsed light of high intensity from the green to the red range of the visible spectrum, and can be used to easily attain resolutions of tens of nanometers in a STED image. The physical principles of the SRS light source are discussed. The implementation of three versions with increasing STED imaging performance is demonstrated, with repetition rates increasing from tens of kHz to 20 MHz. With the 20 MHz SRS source beam scanning was incorporated into the STED microscope setup and used for sub-diffraction imaging of living cells expressing GFP- and YFP-fusion proteins. To date the SRS light source provides the best option for sub-diffraction STED imaging with GFP.

Translation of abstract (German)

Lichtquellen, die spektrale Flexibilität im gelb-orangen Bereich des sichtbaren Spektrums bieten, sind für die STED-Mikroskopie (engl. stimulated emission depletion) von großem Interesse, weil sie beugungsunbegrenzte Abbildungen von fluoreszenten Proteinen, die in diesem Spektralbereich emittieren, insbesondere den grün- und gelb-fluoreszierenden Proteinen (GFP und YFP, vom engl. green fluorescent proteins und yellow fluorescent proteins) und ihren Varianten, ermöglichen. Es gibt Laser, die gelb-oranges Licht produzieren, aber diese haben alle ausgeprägte Nachteile für die Benutzung in einem STED-Mikroskop. Titan:Sapphir-Laser, die optische parametrische Verstärker pumpen, werden verwendet, sind aber komplexe Systeme, die oft sorgfältige Justage benötigen. Faserlaser, die nur eine Wellenlänge emittieren, können benutzt werden, bieten aber nicht die wertvolle Spektralflexibilität an. Superkontinuumfaserlaser, die breite Ausgangspektren produzieren, haben eine niedrige Konversionseffizienz vom Pumplicht zum schmalen genutzten Spektralbereich, was schließlich die Repetitionsrate und die Ausgangsleistung in diesem Spektralbereich begrenzt. Diese Dissertation präsentiert eine neuartige Lichtquelle für die STED-Mikroskopie, die auf stimulierter Raman-Streuung (SRS) in handelsüblichen optischen Fasern basiert. Die Quelle produziert gepulstes Licht mit hoher Intensität vom grünen bis zum roten Spektralbereich des sichtbaren Lichtspektrums und kann auf einfache Weise eingesetzt werden, um eine Auflösung von Dutzenden von Nanometern in einer STED-Aufnahme zu erreichen. Die physikalischen Grundlagen der SRS-Lichtquelle werden erläutert. Der Einsatz von drei Versionen mit steigendem Leistungseigenschaften wird gezeigt, mit steigenden Repetitionsraten von ein paar Dutzend kHz bis 20 MHz. Mit der 20 MHz-SRS-Quelle wird Strahlabtastung implementiert und für beugungsunbegrenzte Aufnahmen von lebenden Zellen, die GFP- und YFP-Fusionsproteine exprimierten, eingesetzt. Derzeit bietet die SRS-Lichtquelle die beste Option für beugungsunbegrenzte STED-Aufnahmen mit GFP.