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MusD transposable elements and their impact on endogenous gene regulation

Aktas, Tugce

German Title: MusD Transposons und deren Auswirkung auf die Genregulierung des Wirtgenoms

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Abstract

In this study, I investigated the role of MusD endogenous retroviruses as controlling elements in the loci they are inserted in and a novel mechanism through which the host genome could restrict their ability to change gene expression patterns. De novo insertions of two MusD elements into the Fgf8 locus were found to be the cause of Dactylaplasia mutations. When MusDs are situated between the regulatory elements driving Fgf8 in the limb apical ectodermal ridge (AER) and its promoter, they act as enhancer blockers and down-regulate Fgf8 expression in this domain. Concomitantly, they also hijack these enhancers to drive their own expression in the limbs. We propose that MusD’s enhancer-blocking activity concurrent with its transcription has a broader impact on the locus by re-routing some Fgf8 enhancers to new target genes, giving rise to ectopic expression of these genes in lieu of Fgf8. This model could also account for the phenotypically related but genomically distinct SHFM3 condition, where large duplications in the orthologous human locus cause a limb malformation similar to Dactylaplasia. They are moving a subset of Fgf8-enhancers away from this gene, a situation that possibly makes them accessible to other genes. Using mouse chromosomal engineering, we showed indeed that such structural changes in the locus are leading to ectopic expression of genes in Fgf8 expression domains. We tested two candidate genes from the locus to assess if their ectopic expression could phenocopy the disease. While we did not manage to reproduce the ectrodactyly phenotype, ectopic-expression of Lbx1 in the AER led to preaxial polydactylies, a feature also observed in several SHFM3 patients (specific for this form of ectrodactly). Thus, it is possible that this already complex disorder involves the combined action of multiple ectopically expressed genes from the locus. Therefore, gene expression programs in this SHFM3/Dactylaplasia locus seem to be altered in related ways for genomically distinct human and mouse mutations. To further understand how MusD could exert this effect, I examined the enhancer blocking activity of MusDs using ex-vivo assays. These experiments identified several regions within MusD, which have insulator properties as strong as the prototypic HS4 region from the chicken beta-globin locus. This is providing strong evidence that MusDs could interfere with the expression of endogenous genes, by working as a mobile insulator element. Indeed, I showed that of a MusD found between the co-regulated Olig2 and Olig1 genes led to changes in their overall and relative expression levels. These changes and the effects of MusD in Dactylaplasia mice were intriguingly only observed if these elements were unmethylated. When their 5’ LTRs were epigenetically repressed, gene expression levels were similar to wild type (i.e. in the absence of MusD) and no phenotype was observed. These observations suggested that MusD expression and effects were depending on epigenetic control over this element. Importantly, the epigenetic status of MusD appeared to be strictly dependent on the presence of an additional locus, Mdac, which is polymorphic amongst mouse strains. The resistant strain had completely methylated MusD 5’LTRs in contrast to almost complete lack of methylation in the permissive strain, hence the origin of the Mdac allele determined the cytosine methylation levels of MusD 5’LTR. This effect is limited to a few of MusD elements, as many of them are in heterochromatin regions. Nevertheless, Mdac seems to be a general controlling factor of MusD, since the strain-specific, differential methylation is consistent in all tested tissues independent of its expression. MusD elements have almost identical LTRs with ETnII elements. However, Mdac did not affect the 5’LTR methylation status of ETnIIs, indicating that Mdac is acting specifically on MusD elements. I genetically mapped the Mdac locus to a small interval of 1.3-1.7 Mb. Interestingly, this region is structurally variable between resistant and permissive strains, with the permissive strains carrying deletion of a cluster of KRAB-ZFP genes and pseudogenes present in the resistant strains. Zinc finger domains of KRAB-ZFPs provide a modular sequence specific binding and their KRAB domain recruits repressing chromatin modifiers. Supporting this identification, we found that a BAC that partially covers the mapped region and contains one KRAB-ZFP from the resistant strain could lead to MusD repression when added to ES cells from a permissive strain. Furthermore, we showed that the deletion of KAP1 in resistant strains led to up-regulation of MusD, along side with other elements. Our findings argue that KRAB-ZFP play major role in counteracting ERVs and that a specific KRAB-ZFP from the Mdac region is targeting repressive modification to MusD elements.

Translation of abstract (German)

In dieser Arbeit habe ich die regulativen Auswirkungen von Insertionen des MusD endogenen Retrovirus in einen Lokus sowie einen neuen Mechanismus untersucht, der Wirtsgenomen erlaubt diese Auswirkungen zu unterdruecken. Zwei unabhängige MusD-Insertionen im Fgf8 Lokus sind ursächlich für Dactylaplasia in Mäusen. Diese MusDs befinden sich zwischen dem Fgf8 Gen, und den regulatorischen Elementen, die dessen Expression in der apikalen ektodermalen Randleiste (AER) steuern. Hierbei blockieren sie die Enhancer-Promoter Interaktion, welches letztendlich zu einer reduzierten Fgf8 Expression in dieser Domäne führt. Parallel dazu nutzten die MusDs diese Enhancer um ihre eigene Expression in den Extremitäten zu steuern. Wir stellen die Hypothese auf, dass diese Vorgänge umfassendere Auswirkungen auf den Lokus haben können und beispielsweise einige Fgf8 Enhancer auf neue Zielgene wirken, welche daraufhin ektop exprimimiert werden. Dieses Modell könnte auch das Auftreten der phänotypisch ähnlichen, doch genomisch unschiedlichen Missbildung SHFM3 erklären, der große Duplikationen im orthologen, humanen Lokus zu Grunde liegen. Diese trennen eine Reihe von Fgf8 Enhancern von ihrem Zielgen und machen sie dadurch verfügbar für andere Gene. Tatsächlich konnten wir mittels „mouse chromosomal engineering“ zeigen, dass solche strukturellen Veränderungen zur ektopen Expression von Genen in den Fgf8 Domänen führen können. Daraufhin haben wir zwei Kandidatengene in diesen Bereichen ektop exprimiert, um ihr Potential den Phänotyp auszulösen zu ermitteln. Obwohl wir nicht in der Lage waren den Ektrodaktyly-Phänotyp zu reproduzieren, führte die Überexpression von Lbx1 in der AER zu preaxialer Polydactyly. Dieser Phänotyp wurde in mehreren SHFM3 Patienten beobachtet, wobei er spezifisch für diese Form der Ektrodaktyly ist. Daher ist es möglich, dass diese Entwicklungsstörung den kombinierten Effekt von einigen ektop exprimierten Genen beinhaltet. Die Genexpression des SHFM3/Dactylaplasia Lokus scheint also in ähnlicher Weise durch unterschiedliche Mutationen in Mensch und Maus verändert zu sein. Um besser verstehen zu können, wie ein MusD Element diesen Effekt auslösen kann, habe ich das Potential von MusD, Enhancer zu blockieren, mittels ex vivo Studien untersucht. Durch diese Experimente wurden mehrere Abschnitte innerhalb von MusD bestimmt, die ähnlich starke Insulatoreigenschaften wie bei der prototypischen HS4 Region des Huhn-Betaglobin Lokus aufwiesen. Dies gibt einen deutlichen Hinweis darauf, dass MusD Elemente die Expression von endogenen Genen stören können. Tatsächlich konnte ich zeigen, dass ein endogenes MusD Element zwischen den ko-regulierten Genen Olig2 und Olig1 zu einer Veränderung der absoluten und relativen Expression dieser Gene führt. Interessanterweise waren die Veränderungen in Dactylaplasia Mäusen nur zu beobachten, wenn die MusDs unmethyliert vorlagen. Waren hingegen ihre 5' LTRs epigenetisch reprimiert, waren auch die Genexpressionsstärken dem Wildtyp ähnlich und kein Phänotyp trat auf. Diese Beobachtungen wiesen darauf hin, dass die Expression von MusD, wie auch die weiteren Effekte, von der epigenetischen Kontrolle des Elements abhängen. Dabei ist wichtig zu erwähnen, dass dieser epigentische Zustand von einem weiteren Lokus, Mdac, abhängt, der in Mauslinien polymorph vorliegt. Die resistente und phänotypisch normal Mauslinie zeigt eine vollständige Methylierung der MusD 5' LTRs, welche hingegen bei der permissiven Linie fast völlig demethyliert vorliegen. Diese Wirkung des Mdac Allels ist auf wenige MusD Elemente begrenzt. Gleichwohl scheint Mdac ein universeller Kontrollfaktor für MusD zu sein, da die differentielle Methylierung durchgängig in allen getesteten, exprimierenden wie auch nicht exprimierenden, Geweben auftrat. MusDs besitzen nahezu identische LTRs wie die verwandten EtnII Elemente. Allerdings beeinflusst Mdac nicht den Methylierungsstatus dieser Elemente und scheint daher MusD spezifisch zu sein. Ich habe den Mdac Lokus auf ein kleines Intervall von 1,3 – 1,7 Mb genetisch kartiert. Diese Region ist zwischen resistenten und permissiven Mauslinien strukturell variabel, wobei die permissiven Linien eine Deletion eines KRAB-ZFP Gen-Clusters und einiger Pseudogene aufweisen. Die Zinkfingerdomänen von KRAB-ZFPs können DNS Sequenz-spezifisch binden, und ihre KRAB-Domänen rekrutieren Chromatin modifizierende Proteine. Folgerichtig weisen ES Zellen von einer permissiven Mauslinie eine Hemmung von MusD auf, wenn sie mit einem BAC aus der kartierten Region mit einem KRAB-ZFP der resistenten Linie injiziert wurden. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass die Deletion von KAP1 in resistenten Mauslinien zu einer gesteigerten Expression von MusD und weiteren retroviralen Elementen führt. Zusammengenommen zeigen unsere Resultate, dass KRAB-ZFP Proteine eine wichtige Rolle bei dem Schutz gegen ERVs spielt und dass ein spezifisches KRAB-ZFP aus der Mdac Region MusD Elemente durch DNA-Modifikation reprimiert.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Furlong, Dr. Eileen
Date of thesis defense: 26. October 2011
Date Deposited: 23. Nov 2011 14:17
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Genregulation, Endogene Retroviren, Transkription <Genetik>
Uncontrolled Keywords: Ektrodaktyly , DNA-MethylierungEctrodactyly , DNA-Methylation
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