English Title: Development of novel methods based on reversible chemical reactions for fluorescence microscopy

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Abstract

Zum besseren Verständnis lebender Organismen sind Informationen über die Organisation und Struktur zellulärer Bausteine und deren detaillierte Funktion unerlässlich. Seit kurzem erlauben neue fluoreszenzmikroskopische Methoden, die Beugungsgrenze der optischen Mikroskopie zu umgehen und dadurch Struk- turen kleiner als 200nm aufzulösen. Einige dieser Methoden basieren auf der photophysikalischen Schaltung der Fluoreszenz durch Bestrahlung mit Licht. In dieser Arbeit wurde der Ansatz der lichtunabhängigen Hochauflösungsmi- kroskopie verfolgt. Dazu wurde die reversible Bindung von Kupfer(II) an einen Liganden genutzt, welche die Fluoreszenz der Sonde ausschaltet. Mit dieser Son- de wurde eine Auflösung von 20nm erreicht, mit der strukturierte Filamente von Zellen weit unter der klassischen Beugungsgrenze aufgelöst werden können. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die chemisch schaltbare Sonde eine Mög- lichkeit zur aberrationsfreien Kolokalisation in biologischen Proben ist. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Methode der Hochauflösungsmikro- skopie bietet einen alternativen Ansatz zu lichtgetriebenen Mechanismen, um Strukturen unter der Beugungsgrenze aufzulösen. Hiermit lassen sich Probleme, wie etwa Phototoxizität und eine hohe Hintergrundfluoreszenz vermeiden, die bei anderen Methoden mit den hohen Lichtintensitäten einhergehen. Eine Li- mitierung der Methode liegt in der Natur der genutzten reversiblen chemischen Reaktion der Sonde. Die Kinetik der Reaktion begrenzt die Kontrolle über die Dauer der An/Aus-Zustände.

Translation of abstract (English)

To improve knowledge on living organisms it is essential to gain information on the organization and structure of cellular building blocks. Recently, new fluore- scence microscopy methods have been established that circumvent the diffrac- tion barrier of optical microscopy and allow resolving structures below 200nm. Some of these methods are based on photophysical switching by irradiation with light. This thesis describes the approach of light-independent high-resolution micros- copy. To this end, the mechanism of reversible binding of Cu(II) to a ligand has been used, which leads to a quenching of the probes fluorescence. This approach yielded a resolution of 20nm, allowing to resolve structured filaments below the classical resolution limit. Additionally, I could show that the probe allows aberration-free colocalization in biological samples. The method developed within this thesis allows an alternative approach for high- resolution microscopy without being based light-driven. Thereby problems like photo toxicity and background noise are reduced as compared to existing ap- proaches using high excitation intensities. A limitation of the presented method is the mechanism of the reversible chemical reaction used to switch the probe. The kinetic of the reaction is limiting control over the duration of on/off-states.