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3D Submillisecond tracking microscopy of single fluorescent particles with adaptive optics

Juette, Manuel Friedrich

German Title: Mikroskopische Submillisekunden-Messung der 3D Trajektorien einzelner fluoreszierender Objekte mit adaptiver Optik

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Abstract

Single particle tracking microscopy in combination with fluorescent labeling has opened the door to investigations of nanoscale dynamics in living cells. While conventional instruments feature temporal resolutions of typically 5–30 ms, nanoscale processes happen on a millisecond or submillisecond time scale. To overcome this limitation, I have developed a single particle tracking microscope with 130 μs temporal resolution and single-fluorophore sensitivity. The instrument acquires 3D trajectories by active tracking of a fluorescent particle with a focused laser beam. This is accomplished by fast beam steering, which is feedback-driven by the detected particle position in the focal volume. For translation of the laser focus along the optical axis, I have implemented a novel vibration-free remote focusing mechanism based on a deformable mirror, an adaptive optics wavefront correction device. In characterization experiments with fluorescent beads, I have found that the instrument is capable of tracking directed motion up to 150 μm/s and free 3D Brownian motion with diffusion coefficients of more than 2 μm²/s. The potential for biological applications is demonstrated by tracking fluorescently labeled viruses on cell membranes and transport vesicles in the cytoplasm of living cells.

Translation of abstract (German)

Mit Fluoreszenzmikroskopie kann die Bewegung teilchenartiger Komponenten in lebenden Zellen verfolgt werden. Solche "Single Particle Tracking"-Experimente beleuchten Längenskalen auf der Nanometerskala, haben aber häufig keinen Zugang zu den kürzesten involvierten Zeitskalen. Diese bewgen sich im Bereich von Millisekunden oder sogar darunter, während konventionelle Instrumente Zeitauflösungen von typischerweise 5–30 ms erzielen. Das Mikroskop, das ich im Rahmen dieser Arbeit entwickelt habe, ermöglicht dreidimensionales Single Particle Tracking mit 130 μs Zeitauflösung und ist empfindlich genug für die Detektion einzelner Fluorophore. Dazu wird ein Laserfokus in Echtzeit dem beobachteten Objekt nachgeführt. Die Fokusposition wird durch ein Feedback-Signal gesteuert, das proportional zur Entfernung des Objekts vom Fokusmittelpunkt ist. Um den Laserfokus entlang der optischen Achse zu bewegen, verwende ich einen verformbaren Spiegel aus der adaptiven Optik. Diese neue Methode erlaubt ein schnelles und vibrationsfreies Einstellen der Fokustiefe. Das Mikroskop verfolgt gerichtete Bewegungen bis zu 150 μm/s und Brownsche Bewegung in 3D mit Diffusionskonstanten über 2 μm²/s. Diese Eigenschaften zeige ich in Experimenten mit fluoreszierenden Mikrokügelchen. Das Instrument eignet sich auch für die Untersuchung lebender Zellen: ich beschreibe Experimente, in denen Viren auf der Zellmembran und Transportvesikel im Cytoplasma verfolgt werden.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Spatz, Prof. Dr. Joachim
Date of thesis defense: 6 December 2012
Date Deposited: 16 Jan 2013 08:55
Date: 6 December 2012
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 530 Physics
Controlled Keywords: Particle-Tracking-Mikroskopie, Adaptive Optik
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