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Characterization and Application of Photon-Statistics in Single-Molecule Measurements for Quantitative Studies of Fluorescently Labeled Samples

Kurz, Anton

German Title: Charakterisierung und Anwendung der Photonenstatistik in Einzelmolekülmessungen zur quantitativen Untersuchung fluoreszenzmarkierter Proben

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The lack of reliable quantitative methods in fluorescence microscopy prevents the detailed investigation of basic molecular processes. Single-molecule fluorescence spectroscopy offers several techniques to determine the stoichiometry of fluorescent probes. Among them, an approach using the single-photon emission of an individual quantum system, also known as photon antibunching, yields access to both the emitter number and their molecular brightness. Previous work demonstrated the feasibility of the method to estimate up to five dyes without further physical characterization. In this work, I investigated and improved the reliability and robustness of this method. I developed different fluorescent probes with a defined label stoichiometry to explore the performance of our approach in experiments. I could demonstrate, in combination with simulations, that it can provide reliable estimates of up to 18 fluorescent emitters at a time resolution of approximately 200 ms. Furthermore, I inspected the dependency of the estimation bias and precision on the laser intensity, the analysis time and the number of expected molecules in detail. My results designate the scope for future stoichiometry determinations. In initial experiments, I analyzed the labeling distributions of different fluorescent probes. In addition, I could combine our counting approach with super-resolution STED-microscopy and identify critical parameters for possible applications

Translation of abstract (German)

Das Fehlen quantitativer Methoden in der Fluoreszenzmikroskopie verhindert eine präzise Untersuchung molekularer Prozesse. Die Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie bietet verschiedene Möglichkeiten die Stöchiometrie fluoreszenzmarkierter Proben nicht-invasiv zu bestimmen. Eine Möglichkeit nutzt das Antibunching, ein Phänomen von Einzelphotonenemittern, zur Schätzung von Anzahl und Helligkeit der Emitter. In vorhergegangenen Arbeiten wurde die erfolgreiche Anwendung dieser Methode für maximal fünf Farbstoffmoleküle demonstriert,jedoch nicht weitergehend charakterisiert. Daher habe ich in dieser Arbeit die Robustheit der Schätzmethode untersucht und weiter verbessert. Ich habe verschiedene Fluoreszenzsonden mit definierter Stöchiometrie entwickelt, mit denen ich die Methode experimentell untersuchen und mit simulierten Daten vergleichen konnte. In verschiedenen Experimenten konnte ich zeigen, dass die Meth- ode zuverlässig bis zu 18 Moleküle mit einer Zeitauflösung von 200 ms zählen kann. In weiteren Untersuchungen habe ich die Abhängigkeiten des systematischen Fehlers und der Präzision des Schätzers von der Laserintensität, der Zeitauflösung und der Anzahl der Moleküle untersucht. Damit konnte ich den Bereich zukünftiger Anwendungen eingrenzen. In ersten Arbeiten konnte ich damit den Markierungsgrad verschiedener Fluoreszenzsonden untersuchen. Zusätzlich konnte ich die Methode in Verbindung mit der STED-Mikroskopie charakterisieren und kritische Parameter für eine mögliche Anwendung identifizieren.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Herten, PD Dr. Dirk-Peter
Date of thesis defense: 31 January 2013
Date Deposited: 08 Feb 2013 07:36
Date: 2013
Faculties / Institutes: The Faculty of Physics and Astronomy > Dekanat der Fakultät für Physik und Astronomie
Subjects: 530 Physics
540 Chemistry and allied sciences
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