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Genotoxicity and effects on fertility, reproduction, development as well as histology in zebrafish (Danio rerio) in a multi-generation study – is there a relationship?

Faßbender, Christopher

German Title: Gentoxizität und Effekte auf Fertilität, Reproduktion, Entwicklung und Histologie im Zebrabärbling (Danio rerio) in einer Mehrgenerationen-Studie - gibt es einen Zusammenhang?

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Abstract

To date, it is unclear whether adverse effects by genotoxic anthropogenic pollutants in the aquatic environment are linked to the decline of fish populations observed in European and North American freshwaters. Therefore, there is a need for investigations into the relationship between genotoxic stress and detrimental effects on development and reproduction in fish. In order to contribute to this field, the present thesis investigates effects of the alkylating genotoxin methyl methanesulfonate (MMS) on genetic integrity, histological status and reproduction in zebrafish (Danio rerio). In addition, in their unexposed offspring (F1), larval development, histological status and reproduction as well as development in the F2 generation were examined at the population level in order to identify potential inheritable effects of genotoxicity. First, methods for the use of primary gonad cells from zebrafish in the alkaline comet assay and histological sections of testis and ovary in the micronucleus test were developed. After in vivo exposure of adult zebrafish to MMS for up to two weeks, in the comet assay, concentrations-dependent genotoxic effects were detected in gonads, liver and gills. Likewise, the micronucleus frequency was elevated by MMS in all of these organs. Thus, the concentration range adequate for MMS exposure in the designated multi-generation experiment was identified. In the next step, zebrafish (F0) were exposed to MMS in vivo from fertilization until the age of one year. Mortality of F0 fish clearly depended on MMS concentrations. In exposed fish, times of first spawning were delayed and fertility was reduced. However, no unequivocal effects on growth were found. In F1 fish derived from MMS-exposed fish, teratogenic effects were increased, larval survival was reduced and sex ratio was shifted towards females. However, compared to the exposed F0 generation, fertility of the non-exposed F1 generation recovered. Development and survival rates recovered in the F2 generation. Significant genotoxic effects were found in the livers, gills and gonads of either sex of the F0 generation. Regarding histopathological aberrations and external lesions, mainly malformations of eyes, gills and liver and a number of neoplasia were observed in both the F0 and F1 generation. According to indirect measurement of MMS concentrations using ion chromatography, real concentrations in the replicate tanks were similar. Taken together, chronic exposure of zebrafish to MMS led to DNA damage in somatic and generative tissues, induced the formation of a multitude of histopathological aberrations and affected survival, reproduction and development in exposed fish and their offspring. Regarding several endpoints, cessation of exposure allowed for recover over the generations. Combining these results with data of previous studies and transferring them to the environmental situation, there is considerable evidence that anthropogenic genotoxicants play a role in the decline of wild fish populations.

Translation of abstract (German)

Es ist bis heute ungeklärt, ob schädliche Effekte gentoxischer anthropogener Schadstoffe in der aquatischen Umwelt zu den Ursachen des Rückgangs der Fischpopulationen in europäischen und nordamerikanischen Süßgewässern zählen. Deshalb ist es angezeigt, den Zusammenhang zwischen gentoxischer Belastung und Beeinträchtigung von Entwicklung und Fortpflanzung bei Fischen weiter zu untersuchen. Um einen Beitrag zu diesem Forschungsfeld zu leisten, betrachtet die vorliegende Arbeit die Auswirkungen des alkylierenden Gentoxins Methylmethansulfonat (MMS) auf die genetische Integrität, das histologische Bild diverser Organe und die Fortpflanzung belasteter Zebrabärblinge (Danio rerio). Darüber hinaus wurden die Larvenentwicklung, das histologische Bild und die Fortpflanzung ihrer nicht belasteten Nachfolgegeneration (F1), sowie die Entwicklung der F2-Generation, auf Populationsebene untersucht, um potentielle erbliche Effekte der Gentoxizität auszumachen. Zunächst wurden Methoden für die Verwendung primärer Gonadenzellen des Zebrabärblings im alkalischen Comet-Assay und histologischer Schnittpräparate von Hoden und Eierstöcken im Mikrokerntest entwickelt. Nach zweiwöchiger Belastung adulter Zebrabärblinge mit MMS in vivo wurden konzentrationsabhängige gentoxische Effekte im Comet-Assay mit Gonaden-, Leber- und Kiemenzellen gefunden. Somit wurde ein für den vorgesehenen Mehrgenerationen-Versuch geeigneter MMS- Konzentrationsbereich abgeschätzt. Anschließend wurde eine Generation von Zebrabärblingen (F0) in vivo von der Befruchtung bis zum Alter von einem Jahr belastet. Die Mortalität der F0-Fische hing deutlich von den MMS-Konzentrationen ab. Bei belasteten Fischen war das erste Laichen verzögert und die Fertilität reduziert. Es wurden jedoch keine eindeutigen Effekte auf das Wachstum gefunden. Bei von belasteten Fischen abstammenden F1-Fischen war die Häufigkeit teratogener Effekte erhöht, das Larvenüberleben reduziert und das Geschlechterverhältnis auf die Seite der Weibchen verschoben. Dennoch erholte sich die Fertilität der unbelasteten F1-Generation im Vergleich zur belasteten F0- Generation. Die Entwicklung und die Überlebensraten näherten sich in der F2-Generation den Kontrollen an. In Leber, Kiemen und Gonaden beider Geschlechter der F0-Generation traten signifikante gentoxische Effekte auf. Bezüglich histopathologischer Veränderungen und äußerlicher Läsionen wurden in der F0- und der F1-Generation v.a. Fehlbildungen der Augen, Kiemen und Leber sowie Neoplasien beobachtet. Die indirekte Messung der MMS-Konzentrationen im Aquarienwasser mittels Ionenchromatographie zeigte ähnliche Realkonzentrationen in den Belastungs-Replikaten. Insgesamt führte die chronische Belastung von Zebrabärblingen mit MMS zu DNA-Schäden in somatischen und generativen Geweben, erzeugte eine Vielzahl histopathologischer Veränderungen und beeinträchtigte die Überlebensrate, Fortpflanzung und Entwicklung der belasteten Fische bzw. ihrer Nachkommen. Das Ende der Belastung ließ bei den nachfolgenden Generationen eine Erholung bezüglich mancher Endpunkte zu. Verbindet man diese Ergebnisse mit Daten vorhergehender Studien und überträgt sie auf die Umweltsituation, gibt es deutliche Anhaltspunkte, dass anthropogene Gentoxine eine Rolle beim Rückgang der Fischpopulationen spielen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Braunbeck, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 14 June 2013
Date Deposited: 26 Jun 2013 06:59
Date: 2013
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
590 Zoological sciences
Additional Information: Chapter II of the thesis is based on the following publication: Faßbender, C., Braunbeck, T. (2013): Assessment of genotoxicity in gonads, liver and gills of zebrafish (Danio rerio) by use of the comet assay and micronucleus test after in vivo exposure to methyl methanesulfonate. Bull Environ Contam Toxicol, DOI 10.1007/s00128-013-1007-6 Chapter III and parts of chapter IV are based on the following publication: Faßbender, C., Braunbeck, T., Reproductive and genotoxic effects in zebrafish after chronic exposure to methyl methanesulfonate in a multigeneration study. Ecotoxicology, DOI 10.1007/s10646-013-1057-x The final publications of these articles are available at http://link.springer.com
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