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CKAMP44 interacts with AMPARs via different protein domains and modulates neuronal morphogenesis

Zhang, Ling

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Abstract

The L-α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors (AMPARs) are glutamate-gated ion channels that are important for fast synaptic transmission and synaptic plasticity in the central nervous system. The AMPARs’ gating properties are tightly regulated by receptor number, subunit composition, co-transcriptional as well as post-translational subunit modifications and by their interactions with auxiliary proteins. Recently, a novel endogenous auxiliary protein of AMPARs, CKAMP44, was identified. CKAMP44 modulates the gating kinetics of AMPARs, such as deactivation, desensitization and recovery from desensitization. However, the detailed molecular mechanisms for the CKAMP44/AMPAR interaction and CKAMP44 regulation of AMPAR gating remain to be resolved. This dissertation unravels different CKAMP44 domains involved in AMPAR interaction and modulation, and investigates new roles of CKAMP44 in neuronal morphogenesis of primary neurons. In order to identify CKAMP44 protein domains that are essential for CKAMP44/AMPAR interaction, AMPAR-mediated current modulation, and CKAMP44 spine delivery, a series of CKAMP44 deletion mutants were generated, expressed in HEK293 cells, primary hippocampal neurons and in neonatal mouse brains, and analyzed by co-immunoprecipitation, immunostaining and electrophysiological recordings. Our results show that the extracellular CKAMP44 domain triggers the modulation of AMPARs’ gating properties. The intracellular Cterminal domain of CKAMP44 is required for postsynaptic localization of CKAMP44, and the R/K domain is needed for the physical CKAMP44/AMPAR interaction as well as for the efficient spine targeting of CKAMP44. The requirement of the R/K domain in CKAMP44/AMPAR binding might explain why the recombinantly expressed CKAMP44 extracellular domain failed to modulate AMPAR activity. In addition to the regulatory function of CKAMP44 on AMPAR-mediated currents, our bidirectional manipulation of CKAMP44 expression in primary hippocampal neurons of Ckamp44–/– and wild-type mice provided evidence that neuronal morphogenesis is modulated by CKAMP44. Primary neurons derived from Ckamp44–/– mice exhibited increased dendritic arborization and spine volume, but decreased spine density when compared to CKAMP44 expressing neurons. IV CKAMP44 overexpression in neurons leads to the opposite results. In addition, CKAMP44 overexpression induced irregular spine morphology and multiple synapses generated at single spines. Therefore, we suggest that, in addition to the modulation of the AMPAR gating, CKAMP44 can tune dendritic arborization and spine formation during neuron maturation.

Translation of abstract (German)

Bei L-α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-propionsäure-Rezeptoren (AMPARs) handelt es sich um Glutamat-gesteuerte Ionenkanäle, die eine wichtige Rolle bei der schnellen synaptischen Transmission und bei der synaptischen Plastizität im Zentralnervensystem spielen. Die Ionendurchlässigkeit von AMPARs wird durch Rezeptoranzahl, Zusammen-setzung der Rezeptoruntereinheiten, co-transkriptionale sowie posttranslationale Modifikationen der Rezeptoruntereinheiten und durch die Wechselwirkung mit eng assoziierten Proteinen streng reguliert. Vor kurzem wurde ein neues endogenes, mit AMPA-Rezeptoren wechselwirkendes Membranprotein, CKAMP44, von unserer Arbeitsgruppe beschrieben. CKAMP44 verändert die Deaktivierung, die Desensitisierung und die Aktivierungskinetik nach der Desensitisierung von AMPA-Rezeptoren. Die genauen molekularen Mechanismen der CKAMP44/AMPAR-Wechselwirkung sowie die Regulation der Ionenkanal-Steuerung durch CKAMP44 waren jedoch bislang unklar. In dieser Dissertation werden verschiedene CKAMP44-Domänen charakterisiert, die an der Wechselwirkung und der Modulation von AMPA-Rezeptoren beteiligt sind, und es werden neue Einflüsse auf die neuronale Morphogenese primärer Neuronen durch CKAMP44 untersucht. Um CKAMP44-Proteindomänen zu identifizieren, die essentiell für die CKAMP44/AMPAR-Wechselwirkung, die Modulation AMPAR-vermittelter Ionenströme und möglicherweise für die neuronale Morphogenese sind, wurde eine Auswahl an verkürzten CKAMP44-Proteinen hergestellt, welche in HEK293-Zellen, primären hippocampalen Neuronen und neonatalen Mäusegehirnen exprimiert und mittels Co-Immunopräzipitation, Immunfärbung und elektrophysiologischer Aufzeichnung analysiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die extrazelluläre Domäne von CKAMP44 für die Modulation der Ionenkanal-Durchlässigkeit von AMPA-Rezeptoren verantwortlich ist. Die intrazelluläre, C-terminale Domäne von CKAMP44 ist für die postsynaptische Lokalisation verantwortlich, während die R/K-Domäne für die CKAMP44/AMPAR-Wechselwirkung und für eine effiziente Translokation von CKAMP44 in die dendritischen Dornen unabdingbar ist. Die Notwendigkeit der R/K-Domäne für die Bindung von CKAMP44 an den AMPA-Rezeptor könnte erklären, weshalb die rekombinant exprimierte, extrazelluläre CKAMP44-Domäne nicht in der Lage ist, die AMPAR-Aktivität zu verändern. Zusätzlich zu der regulatorischen Wirkung von CKAMP44 auf AMPAR-gesteuerte Ionenströme zeigte die bidirektionale Manipulation der CKAMP44-Expression in primären hippocampalen Neuronen von Ckamp44–/– und Wildtyp-Mäusen, dass auch die neuronale Morphogenese durch CKAMP44 beeinflusst wird. Primäre Neuronen aus Ckamp44–/– Mäusen zeigten eine stärkere dendritische Verzweigung und ein größeres Volumen der dendritischen Dornen, jedoch eine niedrigere Dornendichte im Vergleich zu Wildtyp-Neuronen. Eine Überexpression von CKAMP44 in primären Neuronen führte zum entgegengesetzten Effekt. Darüber hinaus besaßen die dendritischen Dornen in diesem Fall eine unregelmäßige Form sowie multiple Synapsen am selben Dorn. Daher sollten zukünftige Analysen berücksichtigen, dass CKAMP44 nicht nur die Modulation der AMPAR-gesteuerten Ionenströme, sondern auch die Verzweigung der Dendriten und die Ausbildung dendritischer Dornfortsätze während der neuronalen Morphogenese beeinflussen kann.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Sprengel, Dr. Rolf
Place of Publication: Heidelberg, Germany
Date of thesis defense: 22 January 2014
Date Deposited: 05 Feb 2014 08:15
Date: 2014
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
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