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Mapping Diffusion Properties in Living Cells

Krieger, Jan Wolfgang

German Title: Bildgebung von Diffusionsprozessen in lebenden Zellen

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Abstract

The function of living cells is based on chemical reactions. It has been shown that the velocity of these reactions is limited by the molecular transport in the cell. Therefore also the spatial organization of a cell plays a major role. In order to investigate such transport processes, fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is often used in combination with fluorescently labeled proteins. In FCS a small subvolume of the cell (~1µm³) is observed with a laser-based microscope. The fluctuations of the fluorescence, emitted from this subvolume, are acquired. An autocorrelation analysis of these fluctuations reveals the concentrations and diffusion coefficients of the labeled particles. Usually, FCS is implemented using a confocal microscope, which can observe only a single spot at any time. For this thesis, FCS was extended to an imaging method, by combining it with light sheet fluorescence microscopy (SPIM). This relatively new widefield microscopy technique allows to observe an arbitrarily positionable, thin plane (diameter: 1-3µm) in the cell. By using a fast electron-multiplying charge-coupled device camera, the combination of SPIM and FCS allowed to map the motion also of relatively small autofluorescent proteins in living cells.

At first, the setup of a light sheet microscope is described. This microscope was designed and optimized for SPIM-FCS measurements in living cells. Several test measurements show the applicability of SPIM-FCS to in vitro samples and to all larger compartments of a living cell (nucleus, cytoplasm, cellular membrane). Afterwards, the usability of several commercially available cameras as image sensor for SPIM-FCS measurements is assessed. At the time of writing, EM-CCD cameras offer the best trade-off between photosensitivity and achievable temporal resolution (~ 500µs). In addition to these linear cameras, also the use of single-photon avalanche diode (SPAD) arrays is investigated. These offer a significantly better temporal resolution (1-10µs) than current EM-CCD cameras, which would render them the ideal image sensor for SPIM-FCS. However, they do not yet reach the photo-sensitivity of EM-CCDs. Two different SPAD arrays were characterized in detail and first successful SPIM-FCS measurements of solute fluorescent molecules could be demonstrated.

In a second step, SPIM-FCS was extended by a cross-correlation analysis (SPIM-FCCS), which allowed for the first time to map the interactions of differently labeled cytosolic molecules in living cells. For this purpose, the cross-correlation function between the fluorescence fluctuations from two different color channels is analyzed. A non-zero amplitude of this cross-correlation function is found only, if the differently labeled molecules interact and move together.

Finally, the methods developed during this project were applied to different cellular systems. The mapping of the mobility of inert tracer molecules of different sizes allowed to measure the viscosity of the cytoplasm in different cells. A position-dependence of this mobility could only be found in the nucleoli. In addition, an important step in the remodelling cycle of the keratin intermediate filament system was investigated. As a third application, SPIM-F(C)CS measurements of different chromatin-associated proteins demonstrated the dynamics in the cellular nucleus. Mobility maps of labeled histone proteins revealed the organization of chromatin in interphase nuclei. In addition, the activity of the nuclear receptor RXR and a transcription factor were mapped.

Translation of abstract (German)

Die Funktion lebender Zellen basiert auf chemischen Reaktionen. Es zeigt sich, dass die Geschwindigkeit dieser Reaktionen durch den Molekültransport in der Zelle limitiert ist und damit auch wesentlich von der räumlichen Organisation der Zelle abhängt. Zur Untersuchung solcher Transportprozesse wird häufig Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) in Verbindung mit fluoreszenzmarkierten Proteinen angewendet. Hierbei beobachtet man mit Hilfe eines Lasermikroskops die Fluktuationen der Fluoreszenz, die aus einem kleinen Untervolumen (~1µm³) der Probe emittiert wird. Eine Autokorrelationsanalyse dieser Fluktuationen ermöglicht es, die Konzentrationen und vor allem den Diffusionskoeffizienten der markierten Teilchen zu vermessen. Üblicherweise wird für FCS ein konfokales Mikroskop eingesetzt, das zu jeder Zeit nur ein einziges Volumen beobachten kann. In der vorliegenden Dissertation wurde FCS zu einer bildgebenden Methode weiterentwickelt, indem es mit Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie (SPIM) kombiniert wird. Diese relativ neue Weitfeldmikroskopietechnik ermöglicht es, gezielt eine beliebig positionierbare Ebene (1-3µm dick) in einer Zelle zu beobachten. Durch Einsatz einer schnellen elektronenverfielfachende CCD-Kamera (EM-CCD) konnte damit die Bewegung auch relativ kleiner autofluoreszenter Proteine in lebenden Zellen ortsaufgelöst vermessen werden. Es wird zunächst der Aufbau eines Lichtscheibenmikroskops beschrieben, das für die Anwendung auf SPIM-FCS in einzelnen Zellen optimiert wurde. Verschiedene Testmessungen zeigen die grundsätzliche Anwendbarkeit von SPIM-FCS in in-vitro-Proben und in allen größeren Kompartimenten lebender Zellen (Zellkern, Zytoplasma, Zellmembran). Anschließend wird die Eignung verschiedener kommerziell erhältlicher Kameras als Bildsensor für SPIM-FCS-Messungen verglichen. Nach aktuellem Stand bieten EM-CCD-Kameras den besten Kompromiss aus Photosensitivität und erreichbarer zeitlicher Auflösung (~500µs). Zusätzlich zu diesen linearen Kameras wird auch der Einsatz von Bildsensoren aus Einzelphoton-Lawinenphotodioden (SPAD arrays) untersucht. Diese bieten gegenüber EM-CCD-Kameras eine deutlich höhere Zeitauflösung (1-10µs) und wären damit ideale Detektoren für SPIM-FCS. Allerdings erreichen sie noch nicht die gleiche Photosensitivität. Zwei verschiedene Sensoren wurden ausführlich charakterisiert und konnten erfolgreich für erste SPIM-FCS Messungen von gelösten Fluoreszenzfarbstoffen eingesetzt werden.

In einem weiteren Schritt wurde SPIM-FCS um eine Kreuzkorrelations-Analyse erweitert (SPIM-FCCS), die es zum ersten Mal erlaubt, auch Interaktionen zwischen verschieden markierten, cytosolischen Molekülen in Zellen zu kartieren. Dazu werden die Fluoreszenz-Fluktuationen aus zwei unterschiedlichen Farbkanälen einer Kreuz-Korrelations-Analyse unterzogen. Eine messbare Kreuz-Korrelation ergibt sich nur, wenn zwei unterschiedlich markierte Moleküle in der Probe eine Bindung eingehen und sich gemeinsam bewegen.

Schließlich konnten die entwickelten Verfahren auf verschiedene zelluläre Systeme angewendet werden. Durch die Kartierung der Mobilität von inerten Molekülen verschiedener Größe konnte unter anderem die Viskosität des Mediums in verschiedenen Zellen bestimmt werden. Eine räumliche Abhängigkeit der Mobilität konnte nur in Nukleoli nachgewiesen werden. Außerdem wurde ein wichtiger Schritt im Remodellierungszyklus des Keratin-Zytoskeletts in Zellen untersucht. Als dritte Anwendung demonstrieren SPIM-F(C)CS-Messungen an verschiedenen Chromatin-assoziierten Molekülen die Dynamik des Zellkerns. Eine Bildgebung der Mobilität von markierten Histon-Proteinen ließ Rückschlüsse auf Organisation des Chromatins zu. Außerdem wurde die Aktivität des nuklearen Rezeptors RXR und eines Transkriptionsfaktors vermessen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Garbe, PD Dr. Christoph S.
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 23 July 2014
Date Deposited: 04 Aug 2014 10:20
Date: 2014
Faculties / Institutes: The Faculty of Physics and Astronomy > Dekanat der Fakultät für Physik und Astronomie
Service facilities > Interdisciplinary Center for Scientific Computing
Service facilities > Heidelberg Collaboratory for Image Processing (HCI)
Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 530 Physics
570 Life sciences
Controlled Keywords: Quantitative Mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Brownsche Bewegung, Diffusion, Anomale Diffusion, Konfokale Mikroskopie
Uncontrolled Keywords: Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) lightsheet fluorescence microscope (LSFM) single plane illumination microscopy (SPIM) single plane illumination microscopy based fluorescence correlation spectroscopy (SPIM-FCS) single plane illumination microscopy based fluorescence cross-correlation spectroscopy (SPIM-FCCS) imaging fluorescence correlation spectroscopy (imFCS) imaging fluorescence cross-correlation spectroscopy (imFCCS) single photon avalanche diode array (SPAD array)
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