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Spektroskopische Eigenschaften kovalent an Glas gebundener Fluoreszenzfarbstoffe und farbstoffmarkierter Peptide

Brunner, Matthias

English Title: Spectroscopic Properties of Covalently Linked Fluorescent Dyes and Dye Labeled Peptides on Glass

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Abstract

Aufgabe dieser Arbeit war es zu zeigen, dass man sowohl unterschiedlich markierte Peptide, als auch gleich markierte Peptide mit und ohne Tryptophan in ihrer spezifischen Umgebung anhand ihrer Fluoreszenzlebensdauer auf Einzelmolekülebene mit hoher Sicherheit identifizieren und unterscheiden kann. Zu diesem Zweck wurden Markierungsfarbstoffe in Lösung und kovalent auf amino-modifizierte Glasoberflächen gebunden untersucht. Ein Peptid enthält Trp, das andere eine nicht-kopplungsfähige Aminosäure. Der Farbstoff wurde an einen zur variablen Aminosäure benachbarten Lys-Rest gebunden. Die farbstoffmarkierten Peptide wurden dann über ihren C-Terminus an amino-modifizierte Glasoberflächen gekoppelt. Die auf trockenen Glasoberflächen gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe und farbstoffmarkierten Peptide wurden mittels konfokaler spektral-auflösender Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie (SFLIM) untersucht. Weitere Messungen erfolgten nach Zugabe einer Flüssigkeit (FTP), die die auf der Oberfläche liegenden Moleküle aufrichtet und damit eine andere Farbstoffumgebung schafft. An den Farbstoff-Peptiden von MR121 war ein markanter Abfall der Lebensdauer durch die Wechselwirkung mit Trp zu beobachten. Carbocyanin-Farbstoffe wie Cy5 zeigten keine spektroskopischen Unterschiede durch die Nähe zu Trp. Allerdings muss sich Trp in unmittelbarer Nachbarschaft zum Farbstoff befinden. Schon eine Aminosäure mehr zwischen Trp und Lys-MR121 verringert die gegenseitige Wechselwirkung so stark, dass praktisch kein Unterschied mehr in den Lebensdauern mit und ohne Trp erkennbar ist. Die reinen Farbstoffe, gemischt auf Glasoberflächen gekoppelt, konnten auf Einzelmolekülebene mit einer Zuordnungssicherheit, aus der Überlappung der Gauß-Kurven ihrer Lebensdauerverteilungen errechnet, von 92 für Cy5/MR121 insgesamt unterschieden werden. Für unterschiedlich markierte Peptide wurden Sicherheiten von 99 für Uni370-Cy5/Uni370-MR121 insgesamt und von 98 für Uni371-Cy5/Uni371-MR121 insgesamt gefunden.

Translation of abstract (English)

The task of this work was to show that one can identify and differentiate both differently marked peptides, and equally labeled peptides with and without Tryptophane with respect to its specific environment on the basis of their fluorescence lifetime on single molecule level with high reliability. For this purpose labeling dyes were examined in solution and covalently bound on amino modified glass surfaces. One peptide contained Trp, the other one a non-coupling amino acid. The dye was bound to a Lys residue neighbouring to the variable amino acid. The dye labeled peptides were then coupled by its C-terminus to amino modified glass surfaces. The fluorescent dyes and dye labeled peptides bound on dry glass surfaces were examined by confocal spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy (SFLIM). Further measurements took place after addition of a liquid (FTP), which detaches the molecules which are lying on the surface, and so it creates a different dye environment. At the dye labeled peptides of MR121 a noticeable decline of the lifetime was observeable by the interaction with Trp. Carbocyanine dyes such as Cy5 did not show spectroscopic differences by the proximity to Trp. However, Trp must be in direct proximity to the dye. Already one amino acid more between Trp and Lys-MR121 reduces the mutual interaction so much that practically no more difference in the lifetime is observable with and without Trp. The pure dyes, mixed coupled on glass surfaces, could be distinguished on the single molecule level with an allocation certainty, calculated from the overlap of the Gauss curves of their lifetime distributions, of 92 for Cy5/MR121 altogether. For differently labeled peptides certainties were found of 99 for Uni370-Cy5/Uni370-MR121 altogether and of 98 for Uni371-Cy5/Uni371-MR121 altogether.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wolfrum, Prof. Dr. Jürgen
Date of thesis defense: 31 January 2002
Date Deposited: 08 Feb 2002 00:00
Date: 2002
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Fluoreszenzfarbstoff, Fluoreszenzlöschung, kovalente Bindung, Tryptophan
Uncontrolled Keywords: Glasoberfläche , Fluoreszenzlebensdauer , farbstoffmarkierte Peptide , Zuordnungssicherheit , anteilige Intensitätfluorescence lifetime , fractional intensity , glass surface , covalent coupling , dye labeled peptides
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