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Fluorescence Quantification by Photon Statistics: From Objective Characterization to Application

Grußmayer, Kristin Stefanie

German Title: Fluoreszensbasierte Quantifizierung mittels Photonenstatistik: Von der objektiven Charakterisierung zur Anwendung

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Abstract

Quantitative information is key to unravel molecular processes in all fields of research. Counting by Photon Statistics (CoPS) is a single molecule technique that provides such quantification for fluorescent species. CoPS exploits the photon antibunching effect to infer the number of independent emitters and their molecular brightness from multiple photon detection events. I laid the foundation for high quality results by improving the microscope detection efficiency more than threefold compared to earlier measurements. Using both simulations and experiments with defined, DNA-based probes, I investigated the critical interplay of fluorophore properties and analysis parameters. I discovered that measurements at high molecular brightness can be ten times faster than previously established which opens new possibilities for time resolved quantification. The findings stress that the choice of analysis parameters is vital and provide an objective measure of fluorophore eligibility for CoPS. I characterized sixteen organic dyes across the visible spectrum based on their molecular brightness and photostability. This study accomplished the transition of CoPS from a proof of concept technique to a widely applicable quantification method. Experiments demonstrated that CoPS can reveal the label number distribution of fluorescent markers, a prerequisite for quantitative investigations in biology. Moreover, I showed that CoPS offers new perspectives for characterization of photophysical processes in photoluminescent materials.

Translation of abstract (German)

Quantitative Daten sind – unabhängig vom Forschungsgebiet – der Schlüssel zum Verständnis von Prozessen, die sich auf molekularer Ebene abspielen. Zählen durch Photonenstatistik (Counting by Photon Statistics, kurz: CoPS) ist eine Einzelmolekültechnik die fluoreszierende Spezies quantifiziert. CoPS nutzt den Photon Antibunching- Effekt um die Anzahl unabhängiger Emitter und deren molekulare Helligkeit aus dem Auftreten von Mehrfach-Photonenereignissen abzuleiten. Als Grundlage für qualitativ hochwertige Ergebnisse habe ich zunächst die Detektionseffizienz des Mikroskops im Vergleich zu früheren Messungen mehr als verdreifacht. Mit Simulationen und Experimenten an definierten, DNS-basierten Proben konnte ich in Folge das kritische Zusammenspiel von Farbstoffeigenschaften und Analyseparametern untersuchen. Ich habe herausgefunden, dass Messungen bei hohen molekularen Helligkeiten bis zu zehn mal schneller als zuvor durchgeführt werden können, was neue Möglichkeiten für zeitaufgelöste Quantifizierung eröffnet. Die Erkenntnisse unterstreichen die Wichtigkeit der Analyseparameterwahl und ermöglichten ein objektives Maß für die Eignung von Fluorophoren für CoPS. Ich habe sechzehn organische Farbstoffe im sichtbaren Spektrum anhand ihrer molekularen Helligkeit und Photostabilität charakterisiert. Diese Studie markiert den Übergang von CoPS von einer reinen Machbarkeitsstudie zu einer breit anwendbaren Quantifizierungsmethode. Ich konnte demonstrieren, dass man mit CoPS die Verteilung der Fluoreszenzfarbstoffe auf Markerproteinen messen kann, eine Grundvoraussetzung für quantitative Untersuchungen in der Biologie. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass CoPS neue Perspektiven für die Charakterisierung von photophysikalischen Prozessen in photoluminiszenten Materialen bietet.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Herten, Prof. Dr. Dirk-Peter
Date of thesis defense: 28 October 2015
Date Deposited: 12 Jan 2016 08:22
Date: 2016
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Service facilities > Bioquant
Subjects: 530 Physics
540 Chemistry and allied sciences
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