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Optogenetic modulation of Delta reveals the role of Notch signalling dynamics during tissue differentiation

Viswanathan, Ranjith

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Abstract

Spatio-temporal regulation of signalling pathways plays an important role in generating diverse responses during the development of multicellular organisms. While increasing number studies are uncovering the importance of signalling dynamics in controlling tissue patterning and morphogenesis, the precise role of signal dynamics in transferring information in vivo is incompletely understood owing to the lack of methods to manipulate protein activity at the relevant spatio-temporal scales. In this PhD thesis, I employ genome engineering in Drosophila melanogaster to generate a functional optogenetic allele of the Notch ligand Delta (opto-Delta), at its endogenous locus. Light mediated activation of opto-Delta disrupts Notch signalling during different developmental stages. Using clonal analysis, I show that optogenetic activation blocks Notch activation through cis-inhibition in signal-receiving cells. To investigate how a Notch input is dynamically translated into a differentiation output, I focused on mesectoderm specification during early Drosophila embryogenesis. Signal perturbation in combination with quantitative analysis of a live transcriptional reporter of Notch pathway activity reveals different modes of regulation at the tissue and cellular level. While at the tissue-level the duration of Notch signalling determines the probability with which a cellular response will occur, in individual cells Notch activation needs to reach a minimum threshold to generate a response. Taken together these results provide novel insights into the dynamic input-output regulation of Notch signalling, supporting a model in which the Notch receptor is an integrator of (noisy) analog signals that generates a digital switch-like behaviour at the level of target gene expression during tissue differentiation.

In order to further test this model, I attempted to develop an optogenetic system to activate Notch in vivo (opto-Notch). Despite showing light-responsive changes in localization, a certain level of Notch is activated even prior to photo-activation, thus necessitating further optimization. Finally, I describe efforts for further characterization of opto-Delta as a tool to spatially perturb signalling, to study Notch signalling during neuroblast delamination, and for adaptation to mammalian cell-culture systems.

Translation of abstract (German)

Die räumlich-zeitliche Regulation von Signalwegen spielt eine wichtige Rolle bei der Erzeugung unterschiedlicher Zellantworten während der Entwicklung mehrzelliger Organismen. Die Bedeutung des dynamischen Verlaufs von Signalübertragungen für die Steuerung der Musterbildung in Geweben und der Morphogenese allgemein wird durch viele Forschungsstudien belegt; wobei die genaue Rolle der Signaldynamiken für die Informationsübertragung in vivo nur unvollständig verstanden ist. Grund dafür ist das Fehlen von Methoden zur Manipulation der Proteinaktivität auf den relevanten räumlich-zeitlichen Skalen. In dieser Doktorarbeit nutze ich Verfahren der Genom-Editierung von Drosophila melanogaster, um ein funktionelles optogenetisches Allel des Notch-Liganden Delta (Opto-Delta) auf endogener Ebene zu erzeugen. Die Licht-abhängige Aktivierung von Opto-Delta ermöglicht es den Notch-Signalweg in verschiedenen Entwicklungsstadien zu unterbrechen. Mithilfe klonarer Analysen zeige ich, dass die optogenetische Stimulierung von Opto-Delta die Induktion von Notch durch cis-Inhibition in signalempfangenden Zellen blockiert. Um zu untersuchen, wie Notch-Signalinput dynamisch in eine Differenzierungsausgabe übersetzt wird, habe ich mich auf die Spezifikation des Mesektoderms während der frühen Drosophila-Embryogenese konzentriert. Die Licht-induzierte Inhibition des Notch-Signalwegs in Kombination mit einer quantitativen Analyse der Signalaktivität eines Live-Transkriptionsreporters brachte verschiedene Regulationsmodi auf Gewebe- und Zellebene zum Vorschein. Während auf der Ebene des Gewebes die Dauer des Notch-Signalinputs die Wahrscheinlichkeit bestimmt, mit der eine zelluläre Antwort auftritt, muss die Notch-Aktivierung in einzelnen Zellen einen Mindestschwellenwert erreichen, um eine Antwort zu generieren. Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse zur dynamischen Input-Output-Regulation von Notch-Signalen ein Modell, in dem der Notch-Rezeptor ein Integrator von (verrauschten) analogen Signalen ist, der ein digitales, schalterartiges Verhalten auf der Ebene der Zielgenexpression während der Gewebedifferenzierung bewirkt. Um dieses Modell weiter zu untersuchen, habe ich versucht, ein optogenetisches System zur Aktivierung von Notch (Opto-Notch) in vivo zu entwickeln. Obwohl Licht-abhängige Änderungen der Proteinlokalisation beobachtet wurden, scheint bereits vor der Lichtaktivierung eine bestimmte Menge von Opto-Notch aktiv zu sein, was weitere Optimierungsschritte der Methode erforderlich macht. Abschließend beschreibe ich die Bemühungen zur weiteren Charakterisierung von Opto-Delta als Instrument zur räumlichen Inhibierung der Notch-Signalübertragung während der Delaminierung von Neuroblasten und zur Adaptierung des Systems in Säugetierzellkultursystemen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: De Renzis, Dr. Stefano
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 26 November 2019
Date Deposited: 08 Jan 2020 11:00
Date: 2019
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
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