German Title: STED-4Pi Mikroskopie

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Abstract

Saturated stimulated emission depletion (STED) has been shown to break Abbe's resolution limit in fluorescence microscopy. This technique suppresses fluorescence at the focal rim by use of a depleting laser pulse. In this thesis, theoretical and experimental examinations show that the combination with another technique, namely 4Pi-confocal microscopy, leads to a yet unreached axial resolution in light microscopy. The central part of this work is the performance of a STED-4Pi experiment. Simulations predict a superresolution of about 30 nm that is confirmed in experiments with ultrathin fluorescent layers. These results are so far considered to have the highest axial resolution for a light microscope. First biological images are recorded with membrane labeled bacteria at 40-50 nm resolution. A major issue is the photostability of the fluorescent dyes. With the bacterial samples, it can be exemplarily demonstrated that longer depletion pulses increase photostability. An amino-reactive dye, that is stable under STED conditions, enabled the first superresolved mammalian immuno-fluorescence images. They reveal a resolution of 50 nm along the optic axis. Finally, a further implementation of an additional STED beam for lateral resolution enhancement is demonstrated. In future, this will enable simultaneous superresolution of at least 100 nm in the lateral and 50 nm in the axial direction.

Translation of abstract (German)

Gesättigte Entvölkerung durch stimulierte Emission (engl.: stimulated emission depletion, STED) durchbricht die Abbesche Auflösungsgrenze in der Fluoreszenz-Mikroskopie. Dabei wird die Fluoreszenz durch einen Abregungs-Laserpuls im fokalen Randbereich verhindert. In dieser Arbeit wird theoretisch und experimentell gezeigt, dass die Kombination mit einer weiteren Technik, der 4Pi-konfokalen Mikroskopie, zu bisher unerreichten Axialauflösungen in der Lichtmikroskopie führt. Zentraler Teil der Arbeit ist der Aufbau eines solchen STED-4Pi Experiments. Simulationen sagen eine Überauflösung von etwa 30 nm voraus, die an dünnen Fluoreszenzschichten verifiziert wird. Dieses Ergebnis gilt als bisher beste Axialauflösung eines Lichtmikroskops. Erste biologische Bilder mit 40-50 nm Auflösung werden an membrangefärbten Bakterien gewonnen. Ein zentrales Problem dieser Technik ist die Fotostabilität der Farbstoffe. An den Bakterien wird exemplarisch gezeigt, dass Verlängerung der Abregepulsdauer zu deutlich höherer Fotostabilität führt. Ein unter STED-Bedingungen stabiler, amino-reaktiver Farbstoff ermöglicht die ersten überaufgelösten Immunofluoreszenz-Aufnahmen an Säugerzellen mittels STED-Technik. Diese haben eine Auflösung von 50 nm entlang der optischen Achse. Abschließend wird gezeigt, dass im STED-4Pi Mikroskop zusätzlich STED-Techniken zur lateralen Auflösungserhöhung einsetzbar sind. Damit wird zukünftig eine simultane Überauflösung von mindestens 100 nm lateral und 50 nm axial möglich werden.