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Entwicklung einer Methode zur zeit- und spektralaufgelösten Präzisionsdistanzmikroskopie auf Einzelmolekülebene

Müller, Christian

English Title: Development of an procedure for time and spectral resolved High Precision Microscopy on Single Molecule level

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PDF, German
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Abstract

In der Fluoreszenzmikroskopie können punktförmige fluoreszierende Lichtquellen, wie z.B. einzelne Fluorophore mit Nanometergenauigkeit lokalisiert werden, indem das erwartete Fluoreszenzbild (Punktabbildungsfunktion) gefittet wird. Wenn jedoch der Abstand zweier fluoreszierender Moleküle kleiner ist als der durch das Rayleigh-Kriterium gegebene Abstand, versagt diese hohe Auflösung, weil sich die beiden Punktabbildungsfunktionen überlagern und weil die Photonenstatistik bei einzelnen Farbstoffmolekülen aufgrund von Photozerstörung eingeschränkt ist. Hier wird eine Technik für die ultrahochauflösende Kolokalisation zweier konventioneller Farbstoffmoleküle mit Nanometergenauigkeit präsentiert. Die Technik basiert auf der kürzlich entwickelten spektral-aufgelösten Fluoreszenzlebensdauermikroskopie (SFLIM), die es ermöglicht, gleichzeitig Fluoreszenzintensität, Fluoreszenzlebensdauer und das Emissionsmaximum aufzunehmen, indem zwei spektral separierte Detektoren verwendet werden. Im Rahmen dieser Arbeit werden Parameter evaluiert und ein theoretischer Ansatz entwickelt, so dass jedes detektierte Photon verlässlich der entsprechenden Farbstoffsorte zugeordnet werden kann. Durch das Benutzen von DNA als ein rigides molekulares Lineal und Simulationen, um die entwickelten Analysemodelle und Fehlerabschätzungen zu überprüfen, konnte gezeigt werden, dass Abstände bis zu 10 nm ± 6 nm zwischen einzelnen Molekülen gemessen werden können.

Translation of abstract (English)

In fluorescence microscopy, localization of point-like fluorescent sources such as single fluorophores can be achieved with nanometer-resolution by fitting the expected microscopic image (point-spread function, PSF) or by simple centroid-finding algorithms. However, if the distance between two fluorescent molecules is smaller than that given by the Rayleigh criterion, high resolution localization fails due to the overlap of the molecules' PSFs and the limited number of photons emitted by single fluorophores. Here, a technique for ultrahigh-resolution colocalization of conventional single fluorescent dyes with nanometer accuracy using two spectral characteristics, i.e. the fluorescence lifetime and the emission wavelength, is presented. The technique is based on the recently developed Spectrally-resolved Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (SFLIM) of single molecules, which enables simultaneous detection of intensity, fluorescence lifetime and emission maximum by using two spectrally separated detectors. This work focuses on the evaluation of parameters and the development of an theoretical approach so that every photon detected is reliably assigned to the corresponding dye species. Using DNA as a rigid molecular ruler system and simulations to test the developed models for analysis and error estimation, it is shown that the distance between single molecules can be measured down to 10 nm with an error of 6 nm depending on photon statistics.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wolfrum, Prof.Dr. Jürgen
Date of thesis defense: 18 December 2003
Date Deposited: 05 Mar 2004 13:19
Date: 2003
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 530 Physics
Controlled Keywords: Einzelmolekülspektroskopie, Abstandsmessung, Zeitauflösung
Uncontrolled Keywords: spektrale Auflösung , Methodenentwicklung
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