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Functional and Molecular Aspects of Xenobiotic Transport in Choroid Plexus

Baehr, Carsten H.

German Title: Transport von ZNS-wirksamen Arzneistoffen an der Blut-Liquor-Schranke

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Abstract

The choroid plexus (CP) epithelium forms the blood-cerebrospinal fluid (CSF) barrier, which along with the blood-brain barrier (BBB) capillary endothelium maintains the fluid environment of the brain. The CP not only secretes CSF, but also transports potentially toxic xenobiotics and waste products of neural metabolism to the blood for eventual clearance in kidney and liver. For several decades it has been known that the CP is actively involved in removing organic anions and other organic compounds from the extra-cellular fluid (Pappenheimer et al., 1961; Villalobos et al., 2002; Miller et al., 2002; Breen et al., 2004; Baehr et al., in press). However, studying CP is difficult, due to complex morphology, anatomical location and small size of the tissue and little is known about the molecular mechanisms, functional complexity and hormonal regulation of organic anion secretion. To further elucidate the underlying mechanisms of organic anion transport across CP epithelium, a primary porcine CP cell culture model was established and characterized on a molecular and functional basis. All cultures were free of contaminating cells, developed intact monolayers and were fully differentiated. Expression of marker protein prealbumin was demonstrated in isolated CP epithelial cells (CPEC) using RT-PCR, immunostaining and Western blot analyses. Alkaline phosphatase and -glutamyl transferase were quantified and cerebrospinal fluid secretion was measured. In addition, two active transport proteins, the MDR1 gene product P-glycoprotein (Pgp) and the multidrug-resistance associated protein 1, were assessed by RT-PCR, immunohistological staining and in Western blots of isolated membrane fractions. Integrity of fully differentiated monolayers was ensured by TEER measurements as well as permeability analyses using marker compounds. Further, functional analyses of Pgp were carried out. Organic anion transport was studied in a mammalian (rat), a comparative elasmobranch and in the in vitro porcine CPEC culture model, using the model compound fluorescein-methotrexate (FL-MTX). FL-MTX transport was shown to be a specific and concentrative, Na+-dependent and metabolism-dependent two-step process. Finally, for the first time, these studies demonstrate that organic anion transport is regulated by protein kinase C (PKC) and PKA. Responsible hormones remain to be identified.

Translation of abstract (German)

Neben dem cerebralen Kapillarendothel, der so genannten Blut-Hirn-Schranke (BHS), stellen die Plexus chorioidei (CP) die zweite aktive Barriere zwischen Blut und ZNS dar. Während die BHS in erster Linie Barrierefunktion hat, sind die CP unmittelbar an der Bildung der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) beteiligt, synthetisieren und sekretieren Proteine und haben verschiedene andere neurogene und endokrine Funktionen. Im Gegensatz zur BHS sind die CP hinsichtlich Wirkstofftransport und Funktionen bzw. Expression von Carrierproteinen weit weniger gut charakterisiert. Seit einigen Jahrzehnten ist bekannt, dass die CP aktiv am Export von organischen Anionen aus der extrazellulären Flüssigkeit beteiligt sind (Pappenheimer et al., 1961; Villalobos et al., 2002; Miller et al., 2002; Breen et al., 2004; Baehr et al., in press). Organische Anionen wie auch Kationen in Form von kreislauffremden Xenobiotika, pflanzlichen und tierischen Giften oder auch Arzneistoffen sind von großer physiologischer, pharmakologischer und toxikologischer Bedeutung (Pardridge und Miller, 1993; Wright und Dantzler, 2004). Eingehende Untersuchungen an CP-Gewebe sind jedoch schwierig auf Grund der morphologischen Komplexität, der anatomischen Lage und der Größe des Gewebes. Die molekularen Prozesse, die funktionelle Vielschichtigkeit und die Regulation des organischen Anionentransports an der Blut-Liquor-Schranke sind daher noch weitgehend unerforscht. Um die Transportprozesse, die für die Elimination von organischen Anionen aus der CSF verantwortlich sind, genauer untersuchen zu können, wurde ein CP-Zellkulturmodell aus Schweineepithel etabliert und auf molekularer, biochemischer und funktioneller Ebene charakterisiert. Alle CP-Kulturen waren frei von kontaminierenden Zellen, bildeten intakte Monolayer und waren vollständig differenziert. Das epitheliale Markerprotein für CP-Gewebe, Prealbumin, wurde durch Genexpressionsanalysen, immunohistochemische Färbungen und Western Blots nachgewiesen. Die Alkalische-Phosphatase- und -Glutamyltransferase-Aktivität sowie das CSF-Sekretionsvolumen wurden bestimmt. Weiter wurden zwei Transportproteine, das MDR1-Genprodukt P-glycoprotein (Pgp) und das Multidrug-Resistance Associated Protein 1 (Mrp1) genauer untersucht. Neben dem Nachweis beider Proteine durch RT-PCR wurde ein semi-quantitativer Vergleich des Expressionsniveaus von Mrp1 zwischen kultivierten und frisch isolierten CP-Epithelzellen durchgeführt. Beide Transportproteine wurden in Immunfärbungen und durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie in CP-Epithelzellen (CPEC) lokalisiert. Mrp1 konnte klar der basolateralen CPEC-Plasmamembran zugeordnet werden. Dagegen konnte Pgp nicht eindeutig an einer der CP-Membranen lokalisiert werden, sondern schien subapikal und apikal ausgebildet zu sein. In weiterführenden Western-Blot-Analysen von CP-Membranfraktionen wurde die apikale im Gegensatz zur basolateralen Fraktion gefärbt. In abschließenden in vitro-Untersuchungen von Pgp konnte jedoch keine signifikante funktionelle Aktivität des Transportproteins nachgewiesen werden. Der Transport von organischen Anionen wurde in einem Säugetier-CP-Modell (Ratte), einem vergleichenden Elasmobranchii-Modell (Dornhai) und in Zellkultur (Schwein) mit Hilfe des Modellsubstrats Fluorescein-Methotrexat (FL-MTX) untersucht. Die Elimination von FL-MTX aus der CSF erfolgt spezifisch und konzentrativ und ist ein metabolismus- und Na+-abhängiger Zwei-Stufen-Prozess. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Regulation des organischen Anionentransports über die Proteinkinasen (PK) PKC und PKA erfolgt. Die Identifizierung der verantwortlichen Hormone bleibt zu klären.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Fricker, Prof. Dr. Gert
Date of thesis defense: 4. February 2005
Date Deposited: 04. Apr 2005 14:35
Date: 2005
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Plexus chorioideus, Blut-Liquor-Schranke, Permeation, Zellkultur
Uncontrolled Keywords: Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier , Transport , Cell Culture
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