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Optimal de-excitation patterns for RESOLFT-Microscopy

Keller, Jan

German Title: Optimale Abregungsverteilungen in der RESOLFT-Mikroskopie

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Abstract

RESOLFT microscopy has been the first method that is capable of non-invasively resolving three dimensional structures with real subdiffraction resolution using visible light. It exploits the strong nonlinear saturation of a reversible optical transition. A focal intensity pattern is essential that de-excites or de-activates dyes outside the remaining ultrasharp effective focal spot. For a given amount of available power, the steepest applied de-excitation pattern will yield the highest resolution. In this thesis, for the first time, a comprehensive search, optimization and characterization of de-excitation patterns is performed. The microscope’s pupil function is decomposed into orthonormal polynomials which allows the restriction of the space of pupil functions so that boundary conditions are fulfilled. The chosen global optimization algorithm converges reasonably well to pupil functions that can be idealized further to simple shapes. Optimal pupil functions are found according to assumptions made about the practical limitations. The optimization identified a novel, superior de-excitation pattern for circularly polarized light. Its experimental application has led to a hitherto unrivaled lateral resolution of down to 20 nm in biological systems. It is shown that an efficient resolution increase in all spatial directions is only possible by incoherent combinations of de-excitation beams. The optimal choice for current experimental conditions is identified. Finally, a new concept for fast acquisition of high resolution images is developed that is based on the simultaneous creation of compact arrays of sub-diffraction sized fluorescence spots in the sample. An optical setup that can generate the corresponding complex pupil functions is detailed.

Translation of abstract (German)

RESOLFT Mikroskopie war die erste Methode, welche nichtinvasiv dreidimensionale Strukturen mit Hilfe sichtbaren Lichts deutlich unterhalb des Beugungslimits auflösen konnte. Dabei wird die starke nichtlineare Sättigung von reversiblen optischen Übergängen ausgenutzt. Eine fokale Intensitätsverteilung wird benötigt, um Farbstoffe außerhalb eines verbleibenden, sehr scharfen effektiven Fokus abzuregen oder zu deaktivieren. Bei gegebener Stärke der vorhandenen Leistung wird mit der steilsten Intensitätsverteilungen die höchste Auflösung erzielt. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal eine ausführliche Suche, Optimierung und Charakterisierung von Intensitätsverteilungen durchgeführt. Die Pupillenfunktion des Mikroskops wird dabei in orthonormale Polynome zerlegt. Dadurch kann der Raum all dieser Funktionen den Randbedingungen entsprechend eingeschränkt werden. Der ausgewählte globale Optimierungsalgorithms konvergiert so weit, dass die erhaltenen Pupillenfunktionen zu einfachen Formen idealisiert werden können. Für verschiedene Annahmen über limitierende Faktoren wurden optimale Pupillenfunktionen gefunden. Die Optimierung ergab eine neue, verbesserte Intensitätsverteilung, die zirkular polarisiertes Licht benutzt. Ihre experimentelle Realisierung hat zu einer bis dahin unerreichten Auflösung von bis zu 20 nm in biologischen Systemen geführt. Es wird gezeigt, dass eine effiziente Erhöhung der Auflösung in allen Raumrichtungen nur durch inkohärente Kombinationen von Intensitätsverteilungen möglich ist. Die optimale Wahl unter derzeitigen experimentellen Bedingungen wurde gefunden. Desweiteren wurde ein neues Konzept zur schnellen Akquisition hochaufgelöster Bilder entwickelt, welches auf der gleichzeitigen Erzeugung kompakter Anordnungen von fluoreszierenden Foki unterhalb des Beugungslimits beruht. Ein optischer Aufbau, welcher die dazugehörenden komplexen Pupillenfunktionen erzeugen kann, wird detailliert beschrieben.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hell, Prof. Dr. Stefan W.
Date of thesis defense: 18. October 2006
Date Deposited: 08. Feb 2007 15:03
Date: 2006
Faculties / Institutes: The Faculty of Physics and Astronomy > Dekanat der Fakultät für Physik und Astronomie
Subjects: 530 Physics
Controlled Keywords: sted, Fluoreszenzmikroskopie, Singulärwertzerlegung, Auflösungsvermögen, Diskrete nichtlineare Optimierung, Optisches Filter
Uncontrolled Keywords: RESOLFT Mikroskopie , Abregungsverteilungen , Doughnut-förmige fokale FelderRESOLFT microscopy , de-excitation pattern , doughnut-mode focal fields
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