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Analysis of gamma secretase regulation by phosphatidylethanolamine using mammalian and Drosophila melanogaster in vitro and in vivo model systems

Nesic, Iva

German Title: Analyse der Gamma-Sekretase Regulation durch Phosphatidylethanolamin in Drosophila melanogaster und Säugetier in vitro und in vivo Systemen

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Abstract

A?-amyloid peptide (A?), that plays a central role in the pathogenesis of Alzheimer’s disease is derived by sequential proteolytic processing from the amyloid precursor protein (APP) by ?- and ?-secretase. APP is additionally processed through a non-amyloidogenic pathway by ?-secretase. Recent work suggests that amyloidogenesis is highly dependent on the levels of cholesterol within plasma membrane/early endosomes’ microdomains termed “rafts”. Indeed APP cleaving machinery, required for A? generation has been shown to reside in lipid rafts and the secretase activity on APP to depend on membrane cholesterol levels. Counterintuitive to the localization of cleavage machinery, the substratum protein APP localizes, at constitutive levels of expression, in membrane microdomains enriched in phospholipids (PL), so-called non-raft domains. From these two series of results it arises that not only cholesterol-rich rafts but also cholesterol-poor/PL-rich non-rafts could be important modulators of AD implicated APP processing. In this work, I have addressed the question of how changes in the lipidic content of non-raft domains, where APP concentrates, affect proteolytic processing of this protein. As phosphatidylethanolamine (PE), an important regulator of diverse cell processes, accounts for the majority of PL I focused on the regulation of APP proteolyisis by this particular PL. For this purpose I utilized Drosophila melanogaster and mammalian model systems. Confirming previous work, APP was found in the non-raft domains of either insect or mammalian cells, excluded from cholesterol/ergosterol/Flotilin that enrich in rafts. The activity of ?-secretase on APP that is the crucial step in A? generation was assayed in Drosophila in vivo system using fly strains transgenic for human APP-C-terminal fragment, fused to the GAL4-VP16 (GV) transcription factor. Membrane PE levels in these ??secretase reporter flies were depleted by introducing the easPC80 mutation, that affects ethanolamine kinase (ETNK) an enzyme involved in PE synthesis pathway. A strong downregulation of hAPP-Ct processing by ?-secretase, readout by GV triggered cell lethal GRIM and GFP reporter genes expression was observed in low membrane PE flies compared to the ?-reporter flies with wild-type membrane PE levels. The effect of PE on APP proteolysis was additionally observed in mammalian HEK 293 cells stably expressing hAPP. In these cells membrane PE levels were altered by the treatment with RNAi directed against diverse PE synthesis enzymes including ETNK. Membrane PE level decrease, caused by RNAi treatment was shown to correlate with a downregulated ?- and ?-secretase processing of APP and correspondingly an elevated ?- secretase activity on APP. In the present study I could show that besides cholesterol/raft microdomains, PL (in particular PE), which are the major lipids in APP surrounding non-raft microdomains, appear to be involved in the regulation of APP proteolysis. From all the above I conclude that APP cleavage efficiency is highly dependent on the levels of the lipidic environment of non-raft domains, either because of affecting the degree of accessibility of the responsible cleaving enzymes to APP or by affecting the capacity of these enzymes to cleave the substratum. These are in my view important venues for future investigation, opened by this work.

Translation of abstract (English)

Zusammenfassung Das Amyloid ? Peptid, das eine zentrale Rolle in der Pathogenese von Alzheimer Erkrankung (AD) spielt, entsteht durch die sequentielle Prozessierung des Amyloid Precursor Protein (APP), durch die ?- und ?-Sekretase. Zusätzlich kann APP in einem nicht-amyloidogenen Prozessierungsweg, durch die ?-Sekretase innerhalb der A?-Domäne proteolytisch gespalten werden. Aktuelle Studien deuten darauf hin, dass die Amyloidogenese in hohem Maße von dem Gehalt an Cholesterol in Mikrodomänen innerhalb der Plasmamembran bzw. früher Endosomen abhängt. Diese cholesterolreiche Membrandomänen werden als “Rafts” bezeichnet. Es ist gezeigt worden, dass die APP-Prozessierungsmaschinerie, welche für die Amyloidogenese benötigt wird, in Rafts angereichert ist, und dass die Aktivität der Sekretasen von dem Cholesterolgehalt in der Membran abhängt. Anders als seine Prozessierungmaschinerie, ist APP unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich in den Membrandomänen lokalisiert, die reich an Phospholipiden (PL) sind und als “Non-Rafts” bezeichnet werden. Diese beiden Erkenntnisse führen zu der Annahme, dass nicht nur cholesterolreiche, sondern auch die cholesteroarme/PL-reiche Membran- Mikrodomänen eine entscheidende Rolle in der Regulierung der APP-Prozessierung und der Entstehung des pathogenen A?-Peptids spielen. In der vorliegenden Arbeit habe ich die Frage untersucht, ob und wie die Veränderungen in der Lipidkomposition der Non-Raft-Domänen, wo APP konzentriert ist, dessen proteolytische Prozessierung beeinflussen. Da Phosphatidylethanolamin (PE) zu den Hauptbestandteilen von Non-Raft-Mikrodomänen zählt, wurde im Ramhen dieser Arbeit die Regulierung der APP-Prozessierung durch dieses spezielle PL eingehend untersucht. Zu diesem Zweck wurden humane Zellen und Drosophila melanogaster als experimentelle Systeme verwendet. In Übereinstimmung mit vorangegangenen Studien, wurde APP sowohl in humanen Zellen als auch in Insektenzellen in den PL-reichen, Non-Raft-Domänen gefunden, in den keine Raft-typischen Lipide (Cholesterol/Ergosterol) und Proteine (Flotillin) angereichert waren. Für die Untersuchung der APP-Proteolyse durch die ?-Sekretase, die den entscheidenden Schritt in der A?-Peptid Entstehung darstellt, wurde das Drosophila in vivo System verwendet, genauer, transgene Reporterstämme, die das humane APP-C-teminale Fragment exprimieren, das mit GAL4-VP16, einer Transaktivatordomäne, fusioniert ist. GAL4-VP16 aktiviert die Transkription der Reportergene, deren Expression ein direkter Indikator der ?-Sekretase-Aktivität ist. Die Reportergene, die ?-Sekretase Aktivität indizieren, sind GRIM, das die Apoptose in der Retina induziert und das Gen für das “Green Fluorescent Protein”, GFP. Der Membrangehalt von PE in ?-Sekretase-Reporterfliegen wurde durch die Kreuzung mit den easPC80-Mutanten reduziert. Die easPC80-Mutation hat einen direkten Einfluss auf das Enzym Ethanolamin Kinase, das für die PE-Synthese verantwortlich ist. Vergleiche zwischen den ?-Sekretase-Reporterfliegen, die einen Wild-typ PE-Membranlevel aufweisen und den Reporterfliegen, mit dem niedrigen PE-Gehalt, zeigen in den letzteren eine starke Reduktion der ?-Sekretase-Aktivität, die durch das Ausmaß des retinalen Zelltodes und der GFP-Intensität indiziert wird. Zusätzlich konnte ein Effekt von Membran-PE auf die APP-Proteolyse in den humanen HEK-Zellen, die das humane APP exprimieren, festgestellt werden. Der Membrangehalt von PE wurde in diesen Zellen durch den RNAi vermittelten knock-down der PE-Syntheseenzyme signifikant beeinflusst. Die Reduktion des Membran-PE-Gehalts, durch die RNAi-Behandlung, zeigte eine klare Korrelation mit der starken Reduktion von ?- und ?-Sekretase-Aktivitäten. Die Prozessierung von APP durch die ?-Sekretase war stark erhöht. In der hier vorliegenden Studie konnte ich zeigen, dass neben Cholesterol und den Raft Mikrodomänen, den PL (hierbei besonders PE), den meist vertretenen Lipid-Spezies, in den APP angereicherten Non-Rafts, eine wichtige Rolle in seiner Proteolyse zukommt. Die oben genannten Gründe lassen deshalb den Schluss zu, dass die APP-Prozessierung stark von der Beschaffenheit der Non-Raft-Domänen abhängig ist. Die Rolle von Non-Rafts in der APP-Regulierung kann darauf beruhen, dass sie den Zugang der Sekretasen zu dem Substrat modulieren oder direkt die Aktivität, der für die APP Prozessierung verantwortlichen Enzyme beeinflussten. Diese Arbeit deutet darauf hin, dass die Non-Rafts ein wesentliches Stellglied für die APP-Prozessierung sind und eröffnet damit neue Einblicke in die Regulationsmechanismen, den die APP-Prozessierung und viel wichtiger, die Amyloidogenese, unterliegen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Konrad Prof. Dr Dr. h.c., Beyreuther
Date of thesis defense: 19 February 2007
Date Deposited: 21 Mar 2007 08:52
Date: 2007
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Alzheimer, Alois
Uncontrolled Keywords: Amyloid Precursor Protein , Amyloidogenese , Gamma-Sekretase , PhosphatidylethanolaminAmyloid Precursor Protein , amyloidogenesis , gamma-secretase , phosphatidylethanolamine
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