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Analysis of the recruitment of the class I myosin Myo5p to endocytic sites in Saccharomyces cerevisiae

Grötsch, Helga

German Title: Analyse der Rekrutierung des Klasse-I Myosins Myo5p zu endocytotischen Stellen in Saccharomyces cerevisiae

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PDF, English (Dissertation H. Grötsch)
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Abstract

In Saccharomyces cerevisiae, dynamic complexes of multiple proteins that assemble in cortical patches at the plasma membrane have been identified as sites of endocytosis. During endocytic vesicle formation, proteins associate and dissociate at these membrane subdomains in a highly defined temporal order. The type I myosin Myo5p is an essential component of the endocytic machinery of S. cerevisiae. The protein has been shown to be localized to the cortical patches in a short time interval, preceding vesicle scission from the plasma membrane. In the present work, we analyze the process of Myo5p recruitment to the endocytic patch. To investigate which domains are required for targeting of the myosin, we used GFP-tagged Myo5p mutants and life cell imaging. Starting with these experiments, we demonstrate the existence of an inhibitory interaction between the Myo5p tail homology 1 (TH1) domain and the most C-terminal portion of the myosin, which includes the SH3 domain. Such interaction precludes the SH3-mediated Myo5p association with Verprolin and Myo5p recruitment to the cortical patch. Using different kinds of experiments, we find strong evidence that the interaction between the Myo5p TH1 domain and the C-terminus is released at the plasma membrane by dissociation of calmodulin from the Myo5p neck domain, which lies immediately upstream of the TH1 domain. Further, we find that calmodulin release increases the affinity of the Myo5p neck and TH1 domains for acidic phospholipids. Based on our results, we propose a model for calmodulin-regulated patch recruitment of Myo5p, whereby calmodulin dissociation from the Myo5p neck at the plasma membrane releases an intramolecular interaction between the Myo5p TH1 domain and the C-terminus, allowing the association of the Myo5p SH3 domain with Verprolin and the interaction of the Myo5p neck and TH1 domains with acidic phospholipids.

Translation of abstract (German)

In Saccharomyces cerevisiae sind dynamische Multiproteinkomplexe, die sich zu sogenannten kortikalen Flecken an der Plasmamembran aufbauen, als Orte der Endozytose identifiziert worden. Während der Bildung des endozytischen Vesikels assoziieren und dissoziieren Proteine an diesen Membrandomänen in hoch geordneter zeitlicher Abfolge. Myo5p, ein Myosin der Klasse I, ist eine essentielle Komponente des Endozytose-Apparates von S. cerevisiae. Es ist beschrieben worden, dass dieses Protein sich in einer kurzen, der Vesikelfusion vorausgehenden Zeitspanne am kortikalen Fleck aufhält. In dieser Arbeit haben wir den Mechanismus der exakten Rekrutierung von Myo5p zu den kortikalen Flecken analysiert. Um zu untersuchen welche Proteindomänen von Myo5p an der Lokalisation des Myosins beteiligt sind, haben wir verschiedene Myo5p-Konstrukte mit GFP fusioniert und deren Lokalisation in lebenden Hefezellen untersucht. Durch diese Experimente fanden wir Hinweise auf eine intramolekulare Interaktion zwischen der zentralen TH1 Domäne und dem C-terminalen Teil von Myo5p, der eine SH3 Domäne mit einschließt. In weiteren Versuchen konnten wir die intramolekulare Interaktion bestätigen und zeigen, dass diese die SH3-vermittelte Interaktion mit Verprolin verhindert und die Rekrutierung von Myo5p an die kortikalen Flecken blockiert. Mit verschiedenen experimentellen Methoden gelangen wir zu überzeugenden Hinweisen, dass die intramolekulare Interaktion in Myo5p durch die Dissoziation von Calmodulin von der Myo5p-Hals-Domäne (die oberhalb der TH1 Domäne liegt) gelöst wird. Unsere Experimente belegen auch, dass die Dissoziation von Calmodulin die Affinität der TH1 Domäne zu sauren Phospholipiden erhöht. Basierend auf unseren Ergebnissen erstellen wir ein Modell für die durch Calmodulin regulierte Rekrutierung von Myo5p an den endozytischen Fleck. Demzufolge dissoziiert Calmodulin an der Plasmamembran von der Myo5p-Hals-Domäne und die Interaktion zwischen der TH1 Domäne und dem C-terminalen Teil von Myo5p wird folglich gelöst. Dies ermöglicht wiederum die Bindung der SH3 Domäne an Veprolin und die Interaktion der TH1 Domäne mit sauren Phospholipiden.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wieland, Prof. Dr. Felix
Date of thesis defense: 16. April 2007
Date Deposited: 15. May 2007 10:47
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > Heidelberg University Biochemistry Center
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Endocytose, Myosin, Calmodulin
Uncontrolled Keywords: Bäckerhefeendocytosis , yeast , myosin , calmodulin
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