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Study of the interaction between the DnaK chaperone and its substrates

Rodriguez, Fernanda Mariana

German Title: Untersuchung der Interaktion des Chaperons DnaK mit Substraten

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PDF, English (Thesis_Fernanda_Rodriguez)
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Abstract

Hsp70 chaperones assist a large variety of protein folding processes in the cell by ATP-controlled cycles of substrate binding and release that are regulated by J-proteins and nucleotide exchange factors. Hsp70 chaperones bind to almost all unfolded proteins but generally do not interact with their native counterparts. However, Hsp70 also recognize certain folded proteins as substrates, like natively folded regulatory proteins, and modulates their activities. Even though the binding to peptide substrates has been extensively studied, it is still unclear how the binding to natively folded substrates occurs. It is also unknown whether Hsp70 proteins keep their substrates in an unfolded conformation in solution or play a more active role by inducing conformational changes on them. The aim of this Thesis was to contribute to a deeper understanding of the Hsp70 interaction with natively folded substrates, studying their conformation and probing possible conformational changes due to the action of Hsp70. I have analyzed the interaction of the E. coli Hsp70 homologue DnaK and its co-chaperone DnaJ with two protein substrates whose activity is regulated by DnaK and DnaJ: the heat-shock transcription factor s32 and the replication initiator protein RepE. Using amide hydrogen exchange experiments combined with mass spectrometry, and deletion and point-mutation constructs, I have identified the DnaK and DnaJ binding sites in s32. I have been able to show that both chaperones influence the conformation of s32 by destabilizing specific regions distant to their binding sites. DnaJ binding to s32 destabilizes a region in close spatial vicinity to the DnaK binding site, thereby explaining the catalytic action of DnaJ in loading s32 onto DnaK and the synergistic stimulation of DnaK’s ATPase activity by the simultaneous interaction of DnaJ and s32. DnaK destabilizes a region in the N-terminal domain, the primary target for the FtsH protease, which degrades s32 in vivo. RepE, on the other hand, performs different functions depending on its oligomeric state: as a dimer it represses its own synthesis while as a monomer it promotes replication initiation. Monomerization of RepE is regulated by DnaK. I have characterized the molecular mechanism of this regulation by investigating the conformation of dimeric RepE wild type and the constitutively monomeric variant RepE54 by amide hydrogen exchange experiments. I have been able to map the dimer interface in RepE and to identify the DnaK binding site which, interestingly, is not close to the dimer interface.

Translation of abstract (German)

Chaperone der Hsp70-Familie sind an einer Vielzahl zellulärer Proteinfaltungsvorgänge beteiligt, indem sie über ATP verbrauchende Reaktionszyklen Substrate binden und freisetzen. Diese Reaktionszyklen werden durch J-Proteine sowie Nukleotidaustauschfaktoren reguliert. Hsp70 Chaperone binden überwiegend ungefaltete Polypeptide, interagieren jedoch im allgemeinen nicht mit deren nativ gefalteten Formen. Hsp70 erkennt aber auch hochspezifisch bestimmte nativ gefaltete Proteine, insbesondere regulatorische Proteine, als Substrate und moduliert deren Aktivität. Obwohl die Bindung an Substrate bereits extensiv untersucht wurde, wobei hauptsächlich Modellpeptide zum Einsatz kamen, ist es immer noch weitgehend unverstanden, wie die Bindung an nativ gefaltete Substrate erfolgt. Außerdem ist unklar, ob Hsp70 Proteine ihre Substrate nur in einem ungefalteten Zustand halten können oder eine aktive Rolle übernehmen, indem sie Konformationsänderungen im Substrat auslösen. Das Ziel dieser Arbeit war, zum Verständnis der Interaktion zwischen Hsp70 und nativ gefalteten Substraten beizutragen, indem deren Konformation und durch Hsp70 verursachte Konformationsänderungen untersucht wurden. Ich analysierte dafür die Interaktion zwischen dem Hsp70-Homologen aus E. coli DnaK sowie dessen Co-Chaperon DnaJ mit zwei Proteinsubstraten, deren Aktivität über DnaK und DnaJ reguliert wird: den Hitzeschocktranskriptionsfaktor s32 und das Replikationsinitiatorprotein RepE. Die Bindestellen von DnaK und DnaJ in s32 wurden mittels Amidprotonenaustausch und Massenspektrometrie sowie über Deletions-und Punktmutationskonstrukte identifiziert. Ich konnte zeigen, dass beide Chaperone die Konformation von s32 beeinflussen, indem sie bestimmte Regionen destabilisieren, welche erstaunlicherweise entfernt von der jeweiligen Bindestelle liegen. Die Bindung von DnaJ an s32 destabilisiert einen Bereich nahe der Bindestelle von DnaK, wodurch die katalytische Aktivität von DnaJ erklärt wird, welche darin besteht, das Substrat auf DnaK zu laden und die ATPase-Aktivität von DnaK synergistisch zu stimulieren. DnaK destabilisiert eine Region in der N-terminalen Domäne, dem Hauptangriffspunkt der Protease FtsH, die s32 in vivo abbaut. RepE führt abhängig vom Oligomerzustand verschiedene Funktionen aus: Als Dimer verhindert es seine eigene Synthese, als Monomer begünstigt es die Initiation der Replikation. DnaK reguliert die Monomerisierung von RepE. Ich konnte den molekularen Mechanismus der Monomerisierung aufklären, indem ich die Konformation des dimeren RepE und einer konstitutiv monomeren Varianten, RepE54, mittels Amidprotonenaustausch-Experimenten verglich. Dadurch konnte ich die Dimerisierungsgrenzfläche kartieren und außerdem die Bindestelle von DnaK identifizieren, welche überraschenderweise nicht in der räumlichen Nähe der Dimerisierungsregion liegt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bukau, Prof. Bernd
Date of thesis defense: 4. May 2007
Date Deposited: 05. Jul 2007 10:28
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Hsp70 , Sigma32 , Deuteriumaustausch , Massenspektrometrie , RepEHsp70 , hydrogen-exchange , mass spectrometry , sigma32 , RepE
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