German Title: Parallelisierte Entleerung des Grundzustandes

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Abstract

RESOLFT was introduced to break the limited resolution in fluorescence microscopy given by thephysical limit of diffraction. RESOLFT needs saturable fluorescence depletion and illumination with spatial regions of zero intensity. Improvements in RESOLFT are still essential since (i) photobleaching restricts the use of large intensities obligate for high resolution, (ii) long acquisition times emerge from single-point scanning, and (iii) RESOLFT puts ahead special requirements on the dye´s photophysical properties. To counteract these problems, this work presents a RESOLFT-type microscope implementing parallelized ground state depletion (GSD). Parallelization allows rather fast image acquisition applying structured illumination combined with widefield detection on a camera. The depletion of the fluophore´s ground state, and thus the fluorescence, is realized using a pump-probe illumination scheme. To increase photostability, the sample was evacuated and cooled to approximately 80 K. Since the population of the triplet state is an intrinsic property of almost every dye and is enhanced by evacuation and low temperatures, parallelized GSD is generally applicable to a wide range of fluorescent markers. Applying parallelized RESOLFT an enhancement in resolution was proven for a bead sample as well as inside a cell. Parallelized GSD microscopy further prevents photostress on both fluorescent label and sample, since it encounters moderate illumination intensities < kW/cm2.

Translation of abstract (English)

Das RESOLFT-Konzept wurde entwickelt, um die Auflösungsgrenze in der Fluoreszenzmikroskopie zu überwinden. RESOLFT benötigt einen sättigbare Fluoreszenzauslöschungmechanismus und eine räumliche Beleuchtung mit dunklen Bereichen. Verbesserungen sind notwendig, da (i) starkes Photobleichen den Einsatz hoher Laser-Intensitäten verbietet, die jedoch für eine hohe Auflösung notwendig sind, (ii) die bisherigen RESOLFT-Verfahren Laserraster Methoden einsetzen und lange Aufnahmezeiten bedingen, und (iii) spezielle Anforderungen an die eingesetzten Farbstoffe gesetzt sind. Um diese Problemen zu beheben, wurde in der vorliegenden Arbeit ein neues RESOLFT-Mikroskop entwickelt, welches den sättigbaren Fluoreszenunterdrückungsprozeß durch Entleerung des Grundzustandes über die Bevölkerung des Tripletzustandes realisiert. Die Bildaufnahme ist durch die parallelisierte Aufnahme mit Hilfe von strukturierter Beleuchtung und großflächiger Fluoreszenzdetektion über eine Kamera wesentlich beschleunigt. Die Entleerung des Grundzustandes eines Farbstoffmoleküles und Löschung der Fluoreszenz geschieht durch ein Zwei-Puls Beleuchtungsschema. Um die Photostabilität der Farbstoffe zu erhöhen, wurde die Probe evakuiert und auf 80 K gekühlt. Da Tripletbevölkerung eine Eigenschaft fast jeden Farbstoffs ist und durch Kühlung verstärkt wird, ist das vorgestellte RESOLFT-Konzept weitreichend einsetzbar. Die vorgestellte Mikroskopiemethode erzielte Auflösungen unterhalb der Beugungsgrenze sowohl für punktförmige Farbstoffproben, als auch innerhalb von Zellen. Die dabei verwendeten Intensitäten von < kW/cm2 üben kaum Photostreß auf die Probe aus.