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Analysis of chaperone function in multi-domain protein folding

Stemp, Markus Johann

German Title: Analyse der Chaperonfunktion bei der Faltung von mehrdomänigen Proteinen

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PDF, German
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Abstract

Proteins are the central molecules of life. To become functionally active, newly synthesized polypeptide chains must fold into unique three-dimensional structures on a biologically relevant time scale. Although the information required for correct folding resides in the linear amino acid sequence of a protein, execution of the folding process under cellular conditions is critically dependent on the assistance of “helper proteins” termed molecular chaperones. This group of proteins shares the common function of binding to newly synthesized non-native proteins to prevent off-pathway reactions which otherwise would lead to misfolding and aggregation. Two major classes of chaperones, the Hsp70s and the chaperonins, have been implicated in de novo protein folding in the cytosol. While Hsp70s are primarily involved in stabilizing nascent chains until a complete domain has emerged from the ribosome and is competent for folding, the barrel-shaped chaperonins provide physically defined compartments inside which complete proteins or protein domains can fold unimpaired by aggregation. Proteins of eukaryotic origin which, on average, have a more complex architecture than their prokaryotic counterparts, often fold inefficiently upon expression in bacterial hosts. For many decades, this phenomenon placed great limitations on the recombinant production of proteins. In the present study, eukaryotic multi-domain proteins were synthesized in cell-free translation systems in order to investigate the contribution of individual chaperones to their de novo folding: Upon expression under chaperone depleted conditions in an Escherichia coli based lysate, the modular eukaryotic protein firefly luciferase was demonstrated to fold by a rapid default pathway, tightly coupled to translation. However, only a minor fraction of the translated protein chains folded correctly. In contrast, supplementation of the lysate with purified trigger factor and DnaK/DnaJ/GrpE increased the amount of native protein, but markedly delayed firefly luciferase folding relative to translation. Interestingly, while the bacterial multi-domain protein ß-galactosidase uses the endogenous chaperone machinery effectively (Agashe et al., 2004), the efficient co-translational domain folding of firefly luciferase observed in eukaryotes is not compatible with the prokaryotic chaperone system. Thus, important differences between bacterial and eukaryotic cells seem to exist in the coupling of translation and folding. Moreover, the bacterial lysate which did not contain any eukaryotic chaperones was further utilized to determine the minimum requirements for the folding of newly synthesized actin. By conducting in vitro translation reactions in the presence of purified components, the chaperonin TRiC was found to be the only eukaryotic chaperone absolutely necessary and sufficient for de novo actin folding. The actin thus produced bound DNase I and polymerized into filaments, hallmarks of its native state. Lysate supplementation with the bacterial chaperonin GroEL/GroES or the DnaK/DnaJ/GrpE chaperones led to mostly soluble actin, yet failed to facilitate its correct folding. Notably, actin folding in the TRiC-supplemented bacterial lysate occurred with slower kinetics when compared to the eukaryotic cytosol. Additionally, TRiC was demonstrated to be capable of mediating the domain-wise folding of modular proteins by their partial encapsulation in the chaperonin cavity. This was based on the fact that upon expression of actin multi-domain fusion proteins both in vivo and in vitro, the proteins properly integrated into yeast cytoskeleton structures as well as formed stable complexes with DNase I. The mechanism of how TRiC might promote the folding of individual protein domains is thereby reminiscent of the domain-wise endoproteolytical degradation of proteins by the proteasome, as reported recently (Liu et al., 2003).

Translation of abstract (German)

Proteine sind die zentralen Bausteine des Lebens. Um ihre Funktion erfüllen zu können, ist es von entscheidender Bedeutung, dass neu synthetisierte Polypeptidketten innerhalb kurzer Zeit in ihre einzigartige dreidimensionale Struktur falten. Obwohl die zur korrekten Faltung benötigte Information in der linearen Abfolge der Aminosäuren eines Proteins enthalten ist, benötigen Proteine zur Faltung unter zellulären Bedingungen die Unterstützung von so genannten „Helferproteinen“, bekannt als molekulare Chaperone. Diese Gruppe von Proteinen hat die Eigenschaft, dass sie an neu synthetisierte nicht-native Proteine bindet und dadurch unproduktive Nebenreaktionen verhindert, die andernfalls zu Fehlfaltung oder Aggregation führen würden. Bei der de novo Faltung von Proteinen im Zytosol sind vorrangig zwei Klassen von Chaperonen beteiligt: die Hsp70-artigen Chaperone und die Chaperonine. Die Hsp70-artigen Chaperone stabilisieren in erster Linie die naszenten Ketten bis eine komplette, zur Faltung fähige, Domäne am Ribosom synthetisiert wurde. Die tonnenförmigen Chaperonine hingegen stellen physikalisch definierte Faltungskompartimente bereit, in denen Proteine oder Proteindomänen, abgeschirmt von den aggregationsfördernden Bedingungen des Zytosols, falten können. Die Faltung von eukaryontischen Proteinen, die im Durchschnitt komplexer aufgebaut sind als ihre prokaryontischen Vertreter, verläuft in bakteriellen Expressionssystemen häufig ineffizient. Dieses Phänomen stellte in der Vergangenheit eine generelle Limitierung bei der Herstellung rekombinanter Proteine dar. In dieser Arbeit wurden mehrdomänige eukaryontische Proteine in zellfreien Translationssystemen synthetisiert, um den Einfluss einzelner Chaperone auf deren de novo Faltung zu untersuchen: Im Falle des eukaryontischen Enzyms Luziferase konnte gezeigt werden, dass dessen Faltung bei der Expression in einem Chaperon-dezimierten Escherichia coli-Lysat schnell und eng gekoppelt an die Translation erfolgt. Die Ausbeute an richtig gefaltetem Protein war allerdings sehr gering. Im Gegensatz dazu führte die Zugabe von gereinigtem Triggerfaktor und DnaK/DnaJ/GrpE zum Lysat zu einer Ausbeutesteigerung an nativem Protein, wobei gleichzeitig die Faltung von Luziferase in Relation zur Translation erheblich verzögert wurde. Während das mehrdomänige bakterielle Protein ß-Galaktosidase die endogene Chaperonmaschinerie optimal zu dessen Faltung nutzen kann (Agashe et al., 2004), ist die ansonsten im eukaryontischen Zytosol beobachtete und sehr effektive co-translationale Domänenfaltung von Luziferase nicht mit dem prokaryontischen Chaperonsystem kompatibel. Das lässt darauf schließen, dass bei der Kopplung von Translation und Proteinfaltung in pro- und eukaryontischen Zellen grundlegende Unterschiede bestehen. Des Weiteren wurde das bakterielle Lysat, welches keine eukaryontischen Chaperone enthält, zur Bestimmung der Mindestanforderungen für die Faltung von neu synthetisiertem Aktin verwendet. Die in vitro Translation von Aktin in Anwesenheit verschiedener gereinigter Chaperone zeigte, dass einzig das eukaryontische Chaperonin TRiC für die de novo Faltung von Aktin ausreichend und absolut essentiell ist. Die native Konformation, des auf diese Weise produzierten Aktins, wurde durch dessen spezifische Bindung an DNase I und Aktinfilamentbildung nachgewiesen. Interessanter Weise erfolgte im TRiC angereicherten Lysat die Aktinfaltung wesentlich langsamer als dies im eukaryontischen Zytosol der Fall ist. Lysate, die mit den bakteriellen Chaperonen GroEL/GroES bzw. DanK/DnaJ/GrpE ergänzt wurden, führten zwar zu größtenteils löslichem jedoch fehlgefaltetem Aktin. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass TRiC durch den partiellen Einschluss von Domänen großer modularer Proteine zu deren domänenweisen Faltung beiträgt. Diese Schlussfolgerung basiert auf der Beobachtung, dass bei der Expression von mehrdomänigen Aktinfusionsproteinen in vivo und in vitro diese entweder in das Aktin-Zytoskelett von Hefen integrieren bzw. einen stabilen Komplex mit DNase I formen. Der Mechanismus, mit dem TRiC die Faltung von mehrdomänigen Proteinen bewerkstelligt, könnte dabei dem kürzlich veröffentlichten endoproteolytischen Abbau von einzelnen Proteindomänen durch das Proteasom ähnlich sein (Liu et al., 2003).

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wieland, Prof. Dr. Felix
Date of thesis defense: 19. November 2007
Date Deposited: 21. Nov 2007 12:15
Date: 2007
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Proteinfaltung
Uncontrolled Keywords: in vitro , co-translational , TRiC , Aktinprotein , folding , chaperone , actin , co-translational
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