English Title: RESOLFT-Microscopy with photoswitchable proteins

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Abstract

Die RESOLFT-Fluoreszenzmikroskopie wurde entwickelt um eine prinzipiell unbegrenzte Auflösung der Fernfeld-Fluoreszenzmikroskopie über die Beugungsgrenze hinaus zu ermöglichen. Bisher wurde die RESOLFT-Mikroskopie einzig über die stimulierte Emission (STED) realisiert, welche sehr hohe Lichtintensitäten benötigt, um die zur Auflösungserhöhung nötige Unterdrückung der Fluoreszenz zu erreichen. Photobleichen begrenzt die einsetzbaren Intensitäten und damit auch die erreichbare Auflösung.In der vorliegenden Arbeit wird die Unterdrückung unerwünschter Fluoreszenz über das reversible Photoschalten zwischen langlebigen Konformationszuständen erreicht, wodurch sehr viel niedrigere Intensitäten (W/cm^2) als bei STED (GW/cm^2) zum Einsatz kommen. Dies vermindert Photostress und erlaubt die Verwendung einer vergleichsweise einfachen technischen Apparatur. Durch den Einsatz photoschaltbarer Proteine wurde erstmals ein RESOLFT-Mikroskop mit endogen exprimierbaren Fluoreszenzmarkern realisiert. Es konnte eine Auflösung von 50-100 nm erreicht werden, die nur durch Aberrationen und durch photophysikalische Eigenschaften der schaltbaren Proteine beschränkt ist. Diese Limitationen sind jedoch nicht von prinzipieller Natur, sondern können gezielt überwunden werden. So wurde an rsFastLime, einer Variante des photoschaltbaren Proteins Dronpa, gezeigt, dass fluoreszierende Proteine durch gezielte Mutagenese im Hinblick auf ihren Einsatz in der RESOLFT-Mikroskopie verbessert werden können.

Translation of abstract (English)

RESOLFT fluorescence microscopy was developed to extend the resolution of far-field microscopy beyond the diffraction limit. So far, the only way RESOLFT-microscopy has been realised is to use stimulated emission depletion (STED), which necessitates very high intensities of light to achieve the fluorescence depletion needed for resolution enhancement, making the attainable resolution mainly limited by photobleaching. In this thesis, the depletion of unwanted fluorescence is achieved by using a reversible photoswitch between persistent, conformational states, thereby allowing the use of much lower intensities (W/cm^2) as compared to STED (GW/cm^2). Photostress is reduced and the experimental setup is simplified. By using photoswitchable proteins it could be shown for the first time that endogenic expressable fluorescent markers are compatible with RESOLFT microscopy. A resolution of 50-100 nm was achieved, only limited by aberrations and the photophysical properties of the switchable proteins. These limitations are not of a fundamental nature but can be systematically overcome. By using rsFastLime, a mutant of the photoswitchable protein Dronpa, it was shown that a fluorescent protein can be optimized with regard to its use in RESOLFT microscopy by systematic mutagenesis.