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Precision measurements with SMI and 4PiMicroscopy

Baddeley, David

German Title: Präzisionsmessungen mittels SMI und 4Pi Mikroskopie

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Abstract

Newly developed farfield light microscopy techniques such as Spatially Modulated Illumination and 4Pi microscopy allow structural measurements on biological objects with a precision very much better than the conventional imaging resolution. This thesis focuses on the improvement of this measurement accuracy, encompassing both changes to the experimental SMI setup and new data analysis procedures. An aberration resistant fit algorithm for SMI microscopy is presented along with similar model based procedures for the analysis of 4Pi and confocal data. These are combined in a framework which allows for robust automatic analysis. A method for deconvolving 4Pi data which shows a refractive index mismatch induced phase shift is also introduced. The devices and the associated algorithms were applied to various biological problems most notably the size of replication foci and the structure of the inner kinetochore. Virtual microscopy simulations were performed to support the interpretation of this data and to obtain insight into the results of the SMI gene structure measurements performed by other group members.

Translation of abstract (German)

Neu entwickelte Methoden der Fernfeld-Lichtmikroskopie wie "Spatially Modulated Illumination" und 4Pi -Mikroskopie erlauben die Bestimmung von Strukturparametern von biologischen Objekten mit einer Genauigkeit, die deutlich besser als die herkömmliche optische Auflösung ist. Diese Dissertation legt den Schwerpunkt auf die Verbesserung dieser Messgenauigkeit, wobei sowohl Änderungen des experimentellen Aufbaus des SMI-Mikroskops als auch neue Methoden der Datenanalyse zum Einsatz kommen. Detailliert beschrieben wird ein Fit-Algorithmus für die SMI-Mikroskopie, der gegen Vezerrungen der Punktbildfunktion stabil ist, sowie Ähnliche modell-basierende Methoden zur Analyse von 4Pi und konfokalen Daten. Diese Techniken sind derart zusammengestellt, dass eine robuste automatische Auswertung möglich ist. Eine Methode für die Entfaltung von 4Pi Bildern, die durch eine Fehlanpassung des Brechungsindex eine Phasenverschiebung aufweisen, wird ebenfalls vorgestellt. Die Mikroskope und die damit verbundenen Algorithmen werden auf verschiedene biologische Fragestellungen, insbesondere auf die Größen von Replikations-foci und die Struktur des Inner-Kinetochor-Komplexes, angewandt. Es wurden Simulationen, basierend auf virtueller Mikroskopie, durchgeführt, um die Interpretation der Daten zu unterstützen sowie die Ergebnisse der SMI-Messungen von Gen-Strukturen besser verstehen zu können.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Cremer, Prof. Dr. Christoph
Date of thesis defense: 19. November 2007
Date Deposited: 07. Jan 2008 11:32
Date: 2007
Faculties / Institutes: The Faculty of Physics and Astronomy > Kirchhoff Institute for Physics
Subjects: 530 Physics
Controlled Keywords: Quantitative Mikroskopie, Vier-Pi-Mikroskopie, Virtuelle Mikroskopie, Mikroskopie, Entfaltung <Mathematik>
Uncontrolled Keywords: 4Pi Microscopy , Fluorescence Microscopy , Deconvolution , SMI Microscopy
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