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The role of Sonic Hedgehog in regulatingproliferation, cell survival, and cell-cycle exit in thezebrafish fin buds and neural-plate derived tissues

Prykhozhij, Sergey

German Title: Die Rolle von Sonic Hedgehog in der Regulation von Zellproliferation, Zellüberleben und Zellzyklusausstieg in den Brustflossenanlagen und den aus der Neuralplatte stammenden Geweben des Zebrafisches

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Abstract

The development of multicellular organisms depends on the integration between pattern formation and the regulation of cell number. The secreted signaling protein Sonic Hedgehog (Shh) has been implicated in directing both of these processes, suggesting it may participate in achieving this integration. The role of Shh in directing pattern formation in vertebrate model systems, including the zebrafish, has been well characterized during the last decades. Among the organs in which the patterning function of Shh has been best studied are the limb buds, the retina, and the neural tube. I therefore chose to study the role of Shh in regulating cell proliferation, cell death, and cell survival in these organs of the zebrafish. In addition, I also examined the interaction between Shh and several other factors directing cell proliferation and cell death, including the secreted signaling protein Fgf, and the transcription factor p53. In the context of the zebrafish paired fin buds, I focused on the interplay between Shh and the Fgf signaling pathways. Shh directs pattern formation along the anterior/posterior axis of the vertebrate limb, whereas several Fgfs in combination direct pattern formation along the proximal/distal axis of the limb. In addition, Shh and Fgf signaling pathways in the limb bud are mutually interdependent. Therefore, I aimed to determine the relative importance of each pathway for proliferation in this organ. In zebrafish shh mutants, both proliferation and Fgf signaling in the pectoral fin buds are initially normal, but later are strongly reduced. Furthermore, pharmacological inhibition of Hh signaling for short periods has little effect on either Fgf signaling, or on cell-cycle gene expression, whereas long periods of inhibition lead to the downregulation of both. By contrast, even short periods of pharmacological inhibition of Fgf signaling lead to strong disruption of proliferation in the fin buds, without affecting Shh signaling. Activation of Fgf signaling by implantation of FGF4-soaked beads into shh mutant pectoral fin buds leads to the rescue of cell-cycle gene expression and proliferation in these organs. These results show that the role of Shh in this process is indirect, and is mediated by its effect on Fgf signaling. By contrast, the activity of the Fgf pathway affects proliferation directly and independently of its effect on Shh. In neural-plate derived tissues such as the retina and the neural tube, Shh is essential for survival of cells during development. Here I identify p53 as the mediator of cell death in shh mutant since in the absence of Shh activity, p53 target genes are induced, and p53 loss leads to suppression of apoptosis in shh mutants. p53 induces apoptosis in the absence of Shh signaling by activating expression of the pro-apoptotic target genes puma and bax1, which induce the intrinsic pathway of apoptosis and whose level of expression correlates with the severity of apoptotic phenotypes. In support of the hypothesis that p53 activation results from loss of Shh signaling, p53 target gene expression and apoptosis are both suppressed by over-expression of dominant-negative PKA in shh mutants. To monitor p53 activation in living zebrafish embryos, I constructed a transgenic line expressing fluorescent protein under the control of the p53-driven promoter. Indeed, p53 reporter expression correlates very well with apoptosis levels in vivo, except in the early retina. Furthermore, p53 reporter can be induced by genotoxic drugs and colocalises with active-Caspase3. p53 reporter-positive cells were also found defective in their cell cycle progression at 48 hpf. Consistent with this result, proliferation assays on the double shh p53 mutant revealed that loss of p53 rescues normal cell-cycle exit and increases the rate of mitosis in the shh mutant retina. Moreover, differentiation of amacrine cells and photoreceptors was rescued in the double shh p53 mutant retina. These results show that in the absence of shh, p53 is required for the induction of apoptosis, and also regulates proliferation, cell-cycle exit and differentiation in the retina. Taken together, my results show that Shh plays an important role in regulating both proliferation and cell survival during vertebrate development, and that it affects these processes distinctly in different tissues. In the context of the paired fin buds Shh directs pattern formation and in addition promotes cell proliferation, via activation of the Fgf signaling pathway. In neural-plate derived tissues Shh not only plays a patterning role, but also promotes cell survival and proliferation by antagonizing activation of the transcription factor p53.

Translation of abstract (German)

Die Entwicklung von multizellulären Organismen hängt von der Integration zwischen Musterbildung und der Regulation der Zellenanzahl ab. Das sekretierte Signalprotein Sonic Hedgehog (Shh) ist in die Regulation beider Prozesse einbezogen worden, was darauf hindeutet, dass es am Erreichen dieser Integration teilnehmen könnte. Die Rolle von Shh beim Regeln der Musterbildung in vertebraten Modellsystemen, einschliesslich dem Zebrafisch, ist während der letzten Jahrzehnten gut beschrieben worden. Unter den Organen, in denen die Musterbildungsfunktion von Shh am besten untersucht worden ist, sind die Gliedanlagen, die Retina, und die Neuraltube. Daher habe ich gewählt die Rolle von Shh in der Regulation von Zellteilung und Zelltod in diesen Organen von Zebrafisch zu untersuchen. Zudem habe ich die Interaktion zwischen Shh und einigen anderen Faktoren untersucht, die Zellteilung und Zelltod regeln, einschliesslich des sekretierten Signalproteins Fgf und des Transkriptionsfaktors p53. Im Kontext der gepaarten Brustflossenanlagen des Zebrafisches habe ich den Akzent auf das Zusammenspiel zwischen Shh und Fgf gesetzt. Shh gestaltet die Musterbildung entlang der vorder/hinteren Achse vom vertebraten Glied, während mehrere Fgfs die Musterbildung entlang der proximal/distalen Gliedachse gestalten. Zudem sind Shh und Fgf Signalwege in der Gliedanlage aufeinander angewiesen. Daher war ich bestrebt den relativen Einfluss eines jeden Signalwegs auf die Zellproliferation in diesem Organ zu bestimmen. In shh Mutanten sind Zellproliferation sowie der Fgf-signalweg in den Brustflossenanlagen anfangs normal, später aber verringern sie sich stark. Darüber hinaus hat eine kurzfristige pharmakologische Inhibition des Hedgehogsignalweges wenig Wirkung, weder auf den Fgf Signalweg, noch auf die Expression von Genen die am Zellzyklus beteiligt sind, während längere Inhibition zur Verminderung von beiden Prozessen führt. Im Gegensatz dazu führt eine kurzfristige pharmakologische Inhibition des Fgfsignalweges zür Störung der zellzyklischen Genexpression und der Zellproliferation in den Brustflossenanlagen, ohne den Shhsignalweg zu beeinflussen. Aktivierung des Fgfsignalwegs durch Implantation von FGF4-getränkten Heparinkügelchen in die Brustflossenanlagen der shh Mutanten führt zur Wiederherstellung der zellzyklischen Genexpression und Zellproliferation in diesen Organanlagen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Rolle von Shh in diesem Prozessen nicht direkt ist, und durch den 7 Effekt auf den Fgfsignalweg vermittelt wird. Im Kontrast dazu wirkt der Fgfsignalweg auf die Zellteilung direkt und unabhängig von seinem Effekt auf Shh. In den aus der Neuralplatte entstehenden Geweben wie die Retina und die Neuraltube ist Shh erforderlich für das Überleben von Zellen während der Entwicklung. In diesem Projekt fand ich heraus, dass p53 ein erforderlicher Vermittler vom Zelltod in der Zebrafisch shh Mutante ist, da p53 Zielgene in der Abwesenheit von Shh Aktivität aktiviert werden, und der Verlust von p53 zur Unterdrückung der Apoptose in den shh Mutanten führt. p53 induziert Apoptose in der Abwesenheit von Shh durch Aktivierung der Expression von proapoptotischen Genen, zum Beispiel puma und bax1, die den intrinsischen Weg der Apoptose induzieren und deren Expressionsniveaus mit dem Schweregrad von apoptotischen Phenotypen korrelieren. Die Hypothese, dass p53 Aktivierung aus dem Verlust von Shh Signaling resultiert, wird des weiteren dadurch unterstützt, dass p53 Zielgenexpression und die Apoptose durch Überexpression von dominant-negativer PKA in den shh Mutanten unterdrückt wird. Um die Aktivierung von p53 in lebenden Zebrafischembryonen zu beobachten habe ich eine transgene Linie konstruiert, die das fluoreszierende Protein GFP unter Kontrolle vom p53-getriebenen Promoter exprimiert. In der Tat korreliert die Expression von diesem p53 Reporter sehr gut mit dem Apoptoseniveua in Zebrafischembryonen, außer in der frühen Retina. Darüber hinaus kann die Expression vom p53 Reporter durch genotoxische Drogen induziert werden und kolokalisiert mit der aktiven Caspase3. Zudem waren p53 Reporter-positive Zellen defektiv in ihrem Zellzyklus, und dem Verlauf durch die G2/M-Phase. Die Untersuchungen von Zellteilung in Doppelmutanten von shh und p53 zeigen, dass der Verlust des p53 Gens in der shh Mutante den normalen Zellzyklusausstieg wieder herstellt, und die mitotische Frequenz während der Neurogenese in der Retina anhebt. Zudem wird Differenzierung von Amakrinzellen und Photorezeptoren in der shh p53 doppelmutanten Retina wiederherstellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass p53 in der Abwesenheit von Shh im Zebrafisch für die Induzierung von Apoptose erforderlich ist, und des weiteren Zellproliferation, Zellzyklusausstieg und Differenzierung in der Retina reguliert. Insgesamt zeigen meine Ergebnisse, dass Shh eine wichtige Rolle in der Regulation von Zellteilung und Zelltod während der Wirbeltierentwicklung spielt, und es beeinflusst diese Prozesse unterschiedlich in verschiedenen Geweben. Im Kontext der gepaarten Brustflossenanlagen reguliert Shh die Musterbildung und fördert die Zellproliferation durch Aktivierung des Fgfsignalweges. In den Geweben die aus der Neuralplatte entstehen spielt Shh nicht nur eine Musterbildende Rolle, sondern fördert auch Zellüberleben und Zellteilung dadurch, dass es der Aktivierung des p53Transkriptionsfaktors entgegenwirkt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Arendt, Prof. Dr. Detlev
Date of thesis defense: 23 July 2009
Date Deposited: 08 Sep 2009 13:29
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > Uni-externe Einrichtungen
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: sonic hedgehog , fgf signaling , p53 , apoptosis , cell survival , cell proliferation , cell-cycle exit , retina , development , differentiation
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