Deutsche Übersetzung des Titels: Einzelmolekülschaltnanoskopie mit 4Pi Detektion: Erhöhte 3D Auflösung auf der Nanometerskala

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Abstract

The spatial resolution of light microscopy was limited by diffraction for a long time. Switching markers between a dark and a bright state was the key element to overcome this limitation. In single marker switching (SMS) microscopy, switching and subsequent localization of single markers enables the creation of two-dimensional superresolution images. The approaches to extend SMS microscopy to the third dimension were hitherto hampered by a substantially anisotropic resolution or limited to samples thinner than half the marker fluorescence emission wavelength. Still, a light microscope allowing three-dimensional subdiffraction imaging of thick samples with a homogeneous and isotropic resolution combined with the ability to differentiate between different types of markers is highly desirable. This thesis presents a nanoscope which combines the SMS concept with the 4Pi-technique to address these important issues. The spherical wavefronts generated by a single fluorescence emitter are collected by two opposing objective lenses of high numerical aperture, brought to interfere and focused onto an area detector. By evaluating higher order moments of the detected spots, single markers can be simultaneously localized within samples of theoretically unlimited thickness with an unsurpassed accuracy. 3D localization accuracies of better than 10 nm within a layer of at least 1 micrometer thickness are shown. Importantly, this 1 micrometer sheet can be placed at any depth within the sample. Further, by splitting the fluorescence into orthogonal polarization states, the 4Pi-SMS setup facilitates the 3D nanoscopy of multiple marker species. The biological applicability of the presented method is proven for different biological samples and for distinct types of markers. Offering a unique combination of multicolor recording, nanoscale resolution, and extended axial depth, this work substantially advances the non-invasive 3D imaging of cells and other transparent materials.

Übersetzung des Abstracts (Deutsch)

Die Auflösung in der Lichtmikroskopie war lange Zeit durch die Beugung limitiert. Das Schalten zwischen hellen und dunklen Zuständen von Markern ist das Schüsselelement zur Überwindung dieser Beschränkung. Die Einzelmolekülschaltmikroskopie (englisch: single marker switching, SMS) ermöglicht durch das Schalten und die Lokalisierung einzelner Marker eine zweidimensionale Bildgebung mit einer Auflösung deutlich unterhalb der Beugungsgrenze. Bisherige Ansätze, die SMS Methode auf die dritte Dimension zu erweitern, führten entweder zu einer erheblich anisotropen Auflösung oder waren auf Proben beschränkt, welche dünner als die halbe Fluoreszenzwellenlänge des Emitters sind. Das ideale Lichtmikroskop sollte jedoch eine homogene und isotrope räumliche Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze in dicken Proben besitzen und gleichzeitig in der Lage sein, zwischen verschiedenen Markertypen zu unterscheiden. In dieser Arbeit wird ein Nanoskop vorgestellt, welches das SMS Konzept mit der 4Pi Technik vereint um die oben genannten Eigenschaften zu erreichen. Hierzu werden die sphärischen Wellenfronten eines einzelnen fluoreszierenden Emitters von zwei sich gegenüber stehenden Objektiven hoher numerischer Apertur gesammelt, zur Interferenz gebracht und auf eine Kamera fokussiert. Durch die Auswertung höherer Momente der detektierten Bildpunktfunktion wird die Lokalisierung einzelner Marker mit bisher unerreichter Genauigkeit innerhalb einer beliebig dicken Probe erreicht. In der vorliegenden Arbeit werden Lokalisationsgenauigkeiten besser als 10 nm in allen drei Raumrichtungen innerhalb eines Detektionsvolumens von mindestens 1 Mikrometer Dicke präsentiert. Hierbei ist zu betonen, dass das Detektionsvolumen beliebig innerhalb der Probe positioniert werden kann. Biologische Anwendungen werden für unterschiedliche biologische Systeme und für verschiedene Markertypen exemplarisch vorgestellt. Durch die Aufteilung des Detektionsignals in orthogonal polarisierte Zustände ist es zudem möglich, eine einfache Differenzierung zwischen unterschiedlichen Markertypen zu implementieren. Durch die bisher einzigartige Kombination von Mehrfarbenaufnahme, Auflösungen im Nanometerbereich und Bildgebung in ausgedehnten Proben stellt diese Arbeit einen wesentlichen Fortschritt in der nichtinvasiven dreidimensionalen Bildgebung dar.