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Abstract

Der Fungus Neurospora crassa ist ein etablierter Modellorganismus zur Untersuchung des molekular-genetischen Netzwerks um das tagesrhythmisch schwingende Gen frequency (frq). Dieses Netzwerk besitzt als sensorisches Bindeglied zu den umgebenden Temperatur- und Lichtbedingungen eine regulierende Signalwirkung für zahlreiche tagesabhängige zellphysiologische Prozesse wie zum Beispiel die Sporenbildung. Dabei ist in den letzten Jahren der Mechanismus der Temperaturwirkung mit wachsendem Interesse untersucht worden und es konnte unter anderem gezeigt werden, dass das Splicing der frq-mRNA eine hohe Temperaturabhängigkeit besitzt, wodurch eine Regulierung der Periodenlänge und der Phase der Schwingung durch Änderungen in der Umgebungstemperatur und damit vermutlich auch die Temperaturkompensation, also die Eigenschaft einer konstanten Periodenlänge bei unterschiedlichen Temperaturen, ermöglicht wird. In theoretischen Studien wurde jedoch auch gezeigt, dass für die Temperaturkompensation mehr als eine biochemische Reaktion für Temperaturänderungen sensitiv sein müssen. Eine wesentliche Frage liegt demnach darin, welche biochemischen Reaktionen eine besonders hohe Empfindlichkeit gegenüber der Temperatur besitzen.

In dieser Arbeit wird über eine biochemisch-quantitative Analyse der Verlauf der frq-Transkript- sowie der FRQ-Proteinmenge bei einem Temperaturanstieg von 18 auf 28°C gemessen und mit dem ebenfalls gemessenen Verlauf bei konstanter Temperatur von 25°C verglichen. Durch die Verwendung von bis zu zwölf technischen Replikaten können die Daten der frq-mRNA-Messung dabei in Anbetracht der t-Statistik mit einer um bis zu fünf Mal höheren Auflösung im Vergleich zu einer Einzelmessung ausgewertet werden und auf diese Weise bereits entsprechend kleinere Änderungen in der mRNA-Menge registriert werden. Desweiteren wird die biologisch-intrinsische Standardabweichung der frq-mRNA-Menge gemessen und in der Analyse mit berücksichtigt.

Die Messungen der frq-mRNA- und der FRQ-Proteinmengen zeigen in beiden Fällen einen unmittelbaren Anstieg nach der Temperaturerhöhung, so dass nicht unmittelbar ersichtlich ist, ob die Temperatur auf die Transkription, die Translation oder beide Prozesse wirkt. Zur numerischen Analyse wird die frq-Genexpression auf der Basis eines gewöhnlichen Differentialgleichungssystems zunächst als dreistufige Rückkoppelungsschleife modelliert. Dabei wird auf den Transkriptionsfaktor White-Collar-Complex (WCC) Bezug genommen, dessen aktivierende Wirkung auf die frq-Genexpression durch steigende Mengen phosphorylierten FRQ-Proteins gehemmt wird. Mit diesem in der Literatur bereits erprobten Goodwin-Modell ist es nach einer numerischen Parameterschätzung möglich, die Messdaten der frq-mRNA- und FRQ-Proteinmengen bei konstanter Temperatur im Rahmen der Standardabweichung zu simulieren. Eine Simulation der Messdaten mit Temperaturanstieg kann mit diesem Modell jedoch selbst mit Temperatursensitivität in allen Reaktionsraten nicht erreicht werden, dies wird erst durch die Einführung einer zusätzlichen Variablen zwischen der Transkription und der Translation möglich. Mit Hilfe dieses vierstufigen Modells wird schließlich eine Sensitivitätsanalyse der einzelnen biochemischen Reaktionen hinsichtlich der Temperatur durchgeführt. Das Ergebnis bestätigt die primäre Wirkung über einen post-transkriptionalen Mechanismus und es zeigt, dass der Anstieg in der Transkriptmenge nach dem Temperaturanstieg auf die Rückkoppelungswirkung über WCC zurückzuführen ist. Die Ergebnisse zeigen jedoch auch, dass zusätzlich eine Temperatursensitivität im Transkriptionsmechanismus vorliegt.