Deutsche Übersetzung des Titels: Fortschritte in der Zwei-Photonen Fluoreszenzmikroskopie zur hochauflösenden anatomischen und funktionellen Untersuchung von Zellpopulationen im intakten Gehirn

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Abstract

Die Zwei-Photonen Mikroskopie hat die hochauflösende Untersuchung einzelner Zellen im Gehirn anästhesierter Tiere ermöglicht. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Weiterentwicklung dieser Technik in Richtung Zellpopulationsstudien im Neokortex von freilaufenden Nagetieren. Insbesondere wurden zwei Miniaturmikroskope, basierend auf der Fluoreszenzanregung durch eine photonische Kristallfaser beziehungsweise durch ein kohärentes Faserbündel, entwickelt und deren Einsatzfähigkeit anhand von in vivo Messungen verifiziert. Eine sinnvolle biologische Anwendung dieser Mikroskope setzt jedoch geeignete Fluoreszenzfärbemethoden voraus. Daher wurden zudem Methoden zur Färbung dreier Zellpopulationen entwickelt. Insbesondere wurden Sindbis- und Lentiviren zum Transfer und der gerichteten Expression genetisch kodierter Fluoreszenzindikatoren in Neuronen eingesetzt. Weiterhin wurde eine Methode zur spezifischen Färbung von Astroglia entdeckt und die transgene Expression von fluoreszierenden Proteinen zur Mikrogliazellfärbung eingesetzt. Mit einem Standard-Zwei-Photonen Mikroskop konnte gezeigt werden, daß sich Neurone und Astroglia im adulten Gehirn morphologisch kaum verändern, während Mikrogliazellen ihre Gestalt dynamisch variieren und schnell auf lokale Hirnverletzungen reagieren. Zudem konnte die spezifische Kalziumdynamik von Neuronen und Astroglia im intakten Gehirn visualisiert werden. Diese Fortschritte im Bereich Miniaturisierung und Fluoreszenzfärbung lassen die optische Messung von verhaltensabhängiger Netzwerkaktivität möglich erscheinen.

Übersetzung des Abstracts (Englisch)

Two-photon microscopy has enabled high-resolution imaging of single cells in the brain of anaesthetized animals. Here we developed two-photon microscopy towards imaging of cell populations in the neocortex of awake behaving rodents. For this purpose, we developed two miniature two-photon microscopes based on fluorescence excitation through a hollow-core photonic crystal fiber and a coherent fiber-bundle, respectively. In addition, we demonstrate their applicability to in vivo imaging. Furthermore, as meaningful biological application critically depends on fluorescence labeling, we developed staining methods for three different cell populations. In particular, we used Sindbisand Lentiviral gene transfer into neurons for targeted expression of fluorescent indicators. We discovered a method for specific staining of astroglia in vivo, and we employed transgenic fluorescent protein expression to label microglia. Using a standard two-photon microscope, we show that in the adult brain neurons and astroglia show overall stable morphologies. In contrast, microglia displayed continuous structural changes, and responded rapidly to local injury. Furthermore, we uncovered the distinctive calcium dynamics underlying neuronal and astroglial cell signaling in vivo. Taken together, these advances in miniaturization and fluorescence labeling promise to enable optical studies of network activity during behavior.