English Title: New methods for size and shape determination of fluorescent nanostructures by usage of SMI microscopy

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Abstract

Bisher ging man bei der Größenbestimmung mit der SMI-Mikroskopie von einem idealen Wellenfeldverlauf aus. Störungen des Wellenfeldes, welche die Punktbildfunktion (PSF) des Mikroskops verändern, wurden nicht berücksichtigt. Durch Verwendung von fluoreszierenden Objekten mit bekannter Farbstoffverteilung als Referenzobjekte konnte für jede Größenmessung eine individuelle Punktbildfunktion des SMI-Mikroskops berechnet werden. Damit wurde für jede Messung eine individuelle R(S)-Kurve, die den Zusammenhang zwischen dem Modulationskontrast R und der Objektgröße S beschreibt, ermittelt. Es werden Größenmessungen an Mikrokugeln mit nominalen Durchmessern zwischen 71 nm und 200 nm vorgestellt. Die Ergebnisse werden mit den Ergebnissen verglichen, die man ohne Verwendung von Referenzobjekten erhielte. Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von Referenzobjekten die Genauigkeit der Größenbestimmung deutlich erhöht. In einem weiteren Teil der Arbeit wird die Formabhängigkeit der R(S)-Kurven durch Einführung neuer Größenmaße verringert. Diese neuen Größenmaße stellen nicht mehr die Gesamtausdehnung der Farbstoffverteilung dar, sondern geben eine mittlere Ausdehnung an. Bei größeren Objekten (d>= ca. 100 nm) bleiben die R(S)-Kurven jedoch formabhängig. Durch Vermessung der Farbstoffverteilung bei zwei verschiedenen Anregungswellenlängen kann für diese größeren Objekte ein Formparameter ermittelt werden. Dieser erlaubt die Auswahl der richtigen R(S)-Kurve. Dazu werden Messungen an Vollkugeln mit einem nominalen Durchmesser von 190 nm vorgestellt.

Translation of abstract (English)

In the past, an ideal wavefield shape was assumed for performing size measurements by SMI microscopy. Disturbances of the wavefield, which modify the point spread function (PSF) of the SMI-microscope, were not considered. By using fluorescent objects with known dye distribution as reference objects an individual point spread function of the SMI microscope could be calculated for each size measurement. This measured point spread function was then used to calculate an individual R(S)-curve, which describes the dependence of the modulation contrast R from the object size S, for the size measurement. In this thesis, size measurements of microspheres with nominal diameters between 71 nm and 200 nm are shown. The results were compared with the results one would obtain without using reference objects. The usage of reference objects increased the accuracy of the size measurements significantly. In a second part of the thesis the shape dependence of the R(S)-curves is reduced by introduction of new size measures. These new size measures are not the total size anymore but a mean size of the dye distribution. For larger objects (d >= ca. 100 nm) the R(S)-curves stay shape dependent. By measuring the modulation contrasts R of those objects using two different excitation wavelengths it is possible to obtain a shape parameter. Knowing this parameter one can choose the correct R(S)-curve. Measurements on spheres with a nominal diameter of 190 nm are shown.