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Dual-Colour STED-microscopy on the Nanoscale

Donnert, Gerald

German Title: Zwei-Farben STED-Mikroskopie auf der Nanoskala

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Abstract

Stimulated emission depletion (STED) microscopy was the first concept for breaking Abbe's diffraction barrier in optical far-field microscopy verified in biological applications. However, the theoretically infinite resolution was limited due to photobleaching of the fluorescent species. In this thesis, dark-state relaxation (D-Rex) has been traced in a comprehensive study on one- and two-photon excitation to crucially reduce photobleaching in general thus leading to a major signal increase per excitation pulse. This facilitated a successful combination of this illumination strategy with STED-microscopy making a 10-fold increase of STED-power feasible. The expansion of STED-microscopy to D-Rex conditions at 250 kHz leads to a yet unattained focal plane resolution ~20 nm, equivalent to an approximate 12-fold multilateral increase of resolution below the diffraction limit. This macromolecular resolution was exemplified in a variety of biological samples, including proteins of cell-junction and focal adhesion, or a neurofilamental protein from the human brain. Finally, the extension to a Dual-colour STED-microscope was achieved to provide nanoscale precise colocalization ability of individual protein clusters in cell biology, thereby sustainably widening the application range of STED-microscopy. The method proved to resolve hitherto uncovered nanopatterns of vesicle proteins on endosomes, as well as localized different proteins in mammalian mitochondria.

Translation of abstract (German)

Gesättigte Entvölkerung durch stimulierte Emission (engl.: STED) ist das erste Konzept, welches die Abbesche Beugungsgrenze in der optischen Fernfeld-Mikroskopie überwindet und erfolgreich in der Zellbiologie angewandt wurde. Jedoch war die theoretisch unbegrenzte Auflösung durch Ausbleichen der Farbstoffmoleküle limitiert. In dieser Arbeit wird in einer umfassenden Studie zur ein- und zwei- Photonen Anregung die Dunkelzustands-Relaxation (engl.: D-Rex) als ein effektives Mittel der Bleichreduzierung nachgewiesen, welche gleichzeitig eine enorme Fluoreszenzsignalzunahme pro Anregungspuls hervorruft. Dies bereitet den Weg für eine erfolgreiche Kombination dieser Anregungsstrategie mit der STED-Mikroskopie und ermöglicht die Anwendung einer 10-fach höheren STED-Energie aufgrund reduzierten Farbstoffbleichens. Damit wird die laterale Auflösung in der STED-Mikroskopie auf ~20 nm erhöht, was einer 12-fachen Auflösungserhöhung über der Abbeschen Beugungsgrenze entspricht. Dieses makromolekulare Trennungsvermögen wird auf eine Vielzahl biologischer Fragestellungen angewendet, einschließlich der Untersuchung von Zellkontaktproteinen und fokalen Zellkontaktstellen sowie der hochaufgelösten Erforschung der Neurofilamenten menschlicher Neuronenzellen. Schließlich wird erstmals die Erweiterung auf ein Zwei-Farben STED-Mikroskop realisiert, das eine Nanoskalen präzise Kolokalisation individueller Proteinkluster ermöglicht und damit die Anwendungsmöglich-keiten der STED-Mikroskopie nachhaltig erweitert. Diese Methode kann bislang unentdeckte Nanostrukturen von Vesikelproteinen auf Endosomen darstellen sowie verschiedene Proteine in Säugetier-Mitochondien hochaufgelöst kolokalisieren.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hell, Prof. Dr. Stefan W.
Date of thesis defense: 18 April 2007
Date Deposited: 11 May 2007 09:34
Date: 2007
Faculties / Institutes: The Faculty of Physics and Astronomy > Institute of Physics
Subjects: 530 Physics
Controlled Keywords: STED, Fernfeld, Mikroskopie, Fluoreszenz
Uncontrolled Keywords: Beugungslimit , Makromolekulare Auflösung , 2-FarbenDiffraction limit , Macromolecular resolution , Dual-colour
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